Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Tip 1 diyabet, insülin salgılayan pankreas beta hücrelerinin otoreaktif T hücreleri tarafından yok edildiği otoimmün bir hastalıktır. İlgili mekanizmaları anlamak, bu hastalık için etkili bir tedavi oluşturmak için içgörüler sağlayacaktır. Burada, in vitro olarak pankreas beta hücrelerinin spesifik cd sekiz pozitif T hücresi aracılı yıkımını gözlemlemek için iki yöntem gösterilmiştir: bir krom 51 bazlı hücre aracılı lenfo sitotoksisite veya KML testi ve her iki yöntem için bir görsel KML testi.

CD sekiz pozitif T efektör hücreleri ilk olarak fare dalakları için hazırlanır: Bir CML testi, bir veya dört hedef beta hücresi örünür, krom 51 ile etiketlenir ve bir efektör hücre ile birlikte kültürlenir. Hedef beta hücreleri öldürüldüğünde, krom 51 serbest bırakılır. Süpernatanlar ve hücre lizatları daha sonra toplanır ve hücre ölümünün derecesini gösteren radyoaktivite seviyeleri, görsel bir KML testi gerçekleştirmek için bir gama sayacı kullanılarak ölçülür: Bir örgü ve dört örgü Hedef beta hücreleri mitokondriyal potansiyel boya ile etiketlenir, TM RM efektör hücreleri pico yeşili ile etiketlenir.

Hücreler birleştirilir ve mitokondriyal membran potansiyelinin dağılması ile gösterilen hücre ölümü oranını incelemek için canlı hücre görüntülemesi yapılır. Bu tahlilin krom salınım tahlili gibi geleneksel tahlillere göre ana avantajı, beta hücre ölümünü gerçek zamanlı olarak gözlemleyebilmemizdir. Ek avantajlar arasında, beta hücrelerinin CD sekiz T hücresi aracılı ölümünün temasa bağlı olup olmadığını belirleme yeteneği ve ayrıca bu test, beta hücre ölümünün yollarını haritalamak için floresan göstergeler kullanılarak genişletilebilir.

Bu yöntem, sitotoksik T hücrelerinin rol oynadığı herhangi bir hastalığın patogenezindeki anahtar soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin etkileri tedaviye ve muhtemelen tanıya kadar uzanır, çünkü mitokondriyal fonksiyon hem beta hücre sağkalımı hem de fizyolojide esastır. Jing Chen ve ben bu prosedürü göstereceğiz.

Bu gösteride kullanılan hedef hücreler, fare beta hücre hatlarıdır, bir örgü ve dört örgü, CD üçteki sarsıntı artı fare beta hücrelerini tanımayan ve öldürmeyen insan lenfosit hücre hattı, kullanılan etkili hücrelerin negatif kontrolü olarak kullanılır. İşte üç ila dört haftalık nod AI dört alfa beta F1 faresinin dalaklarından elde edilen Otoreaktif CD sekiz pozitif T hücresi, hücreleri elde etmek için dalakları beş mililitre buz gibi soğuk HBSS içeren yedi mililitrelik bir cam kuş tüyü homojenizatöre yerleştirerek başlayın, dalağı bir downs homojenizatörü kullanarak homojenize edin, ardından hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve dönüşü takip eden beş dakika boyunca 250 Gs'de santrifüjleyin, Snat'ı atın, ardından kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için, peleti dalak başına beş mililitre hipotonik çözelti içinde yeniden süspanse edin. Buz üzerinde beş dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücre peletini 10 mililitre buz gibi soğuk HBSS santrifüjü ile iki kez yıkayın. Her yıkama arasındaki hücre süspansiyonu, hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk HBSS'de yeniden süspanse eder. Daha sonra bir hemo sitometre kullanarak, hücre sayıları belirlendikten sonra hücreleri sayın

Tekrar santrifüjleyin, daha sonra hücreleri yeniden süspanse edin ve bir T 75 şişesinde mililitre başına beş çarpı 10 ila altı hücre yoğunluğunda beş çarpı 10 ila altı hücre yoğunluğunda RPMI 1640'ı takviye edin. Son olarak, hücreleri aktive etmek için, şişeye sırasıyla 0.1 mikromolar ve mililitre başına 25 birim nihai konsantrasyonlarda AI dört miyop ve IL iki ekleyin, şişeyi üç gün boyunca 37 santigrat derecede %5'lik bir CO2 inkübatörde inkübe edin. Aktive edilmiş hücreler artık ACROMIUM 51 bazlı KML testi veya görsel KML testi için kullanılabilir.

Hücre aracılı lenfo sitotoksisite veya KML testi, CD sekiz aracılı beta hücre ölümünün bir göstergesi olarak hedef hücrelerden krom 51 salınımını kullanır. Krom 51 ile dört hedef beta hücresini etiketlemek, örmek veya örmek için, bunları 200 mikrolitre takviyeli DM E EMM içinde 96 oyuklu bir plakanın kuyusu başına beş kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda tohumlayarak başlayın, 37 santigrat derecede %5 CO2 24 saat inkübe edin. Ertesi gün krom 51'i seyreltin ve DMEM'i 20 mikrolitre başına bir mikro curie konsantrasyonuna takviye edin.

Daha sonra, oyuk başına bir mikro curie elde etmek için hedef beta hücrelerini içeren her bir oyuğa 20 mikrolitre seyreltilmiş krom 51 ekleyin. Plakayı %5 CO2 içeren nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve inkübasyonu takiben üç saat inkübe edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri taze kültür ortamı ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, aktive edilmiş CD sekiz pozitif efektör hücresine, her bir oyukluğa eklenen son hacim 200 mikrolitre olacak şekilde orta ekleyin. Efektörü hedef beta hücre kültürlerinde istenen E ila T oranlarında birleştirin, burada spontan lizis kontrollerini hazırlamak için 20'ye bir, 10'a bir, beşe bir, ikiye bir, bire bir ve 0.25'e bir oranları kullanılır. Hedef beta hücrelerinin altı kuyucuğuna taze orta ekleyin.

Daha sonra plakayı inkübatöre yerleştirin ve 16 saat boyunca ko-kültür efektörüne ve hedef hücrelere yerleştirin. Ertesi gün, süpernatanı altı kez 50 milimetre kireç cam tüplere aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra hücreleri plakaya yüz mikrolitre% 2 SDS'de lyce yapmak ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetlemek için.

Hücre lizatını altı kez 50 milimetre kireç cam tüplerden oluşan yeni bir sete aktarın. Daha sonra, tüm hücre lizatının her bir kuyucuğa yüz mikrolitre steril suda toplandığından emin olmak için, yukarı ve aşağı pipetleyin ve beta hücresi yıkımının derecesini belirlemek için hücre lizat tüplerine ekleyin. Sayımlar yapıldıktan sonra bir gama sayacı kullanarak süpernatan ve lizattaki radyoaktiviteyi ölçün.

Spontan lizizdeki sayımların yüzdesini çıkararak spesifik lizisi belirleyin Kontrol süpernatantları, bu denklemde gösterildiği gibi deneysel süpernatantlardaki sayımların yüzdesinden çıkarın. T hücresi aracılı beta hücre ölümünü gerçek zamanlı olarak incelemek. Mitokondriyal membran potansiyeli, hedef ve efektör kokültürlerin canlı hücre görüntülemesi ile izlenir.

Mikroskopiye hazırlanmak için, modifiye edilmiş ve sterilize edilmiş sekiz iyi odacıklı kapak camı üzerindeki hedef beta hücrelerine bakın, dördüncü hücrelerin 10'u beş kez idi. Slaytları 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 48 saat büyümesine izin verin. Deney gününde, 25 nanomolar ve fenol kırmızısı içermeyen takviyeli DM EM inkübatında mitokondriyal membran potansiyel boyası tetraetil rumin metil ester TMRM'yi 30 dakika boyunca ekleyin.

Hücreler TMRM ile boyandıktan sonra, boyanın denge dağılımını korumak için ortamı beş nanomolar TM RM içeren taze ortamla değiştirin. Daha sonra, aktive edilmiş efektör AI dört T hücresini sayın veya bir hemo sitometre kullanarak hücreleri kontrol edin, hücreleri fenol kırmızısı içermeyen takviyeli DMEM'de uygun konsantrasyonda 15 mililitrelik konik tüplerde yeniden süspanse edin. Daha sonra, aktive edilmiş efektör hücrelere pico yeşili ekleyin veya kontrol hücrelerini mililitre başına bir mikrolitrelik nihai konsantrasyona kadar sarsın.

Tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın, ardından inkübasyonun ardından oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Fenol kırmızısı içermeyen DMEM ekleyerek, kısa bir süre karıştırarak ve 250 GS'de beş dakika santrifüjleyerek hücreleri üç kez yıkayın. Görüntüleme için hücreleri toplamak için, oda slaytını 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de motorlu bir sahne ve nemlendirilmiş bir canlı hücre görüntüleme odası ile donatılmış bir konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin.

Aktive edilmiş pico yeşil lekeli efektör hücrelerini, burada değerlendirilecek efektör-hedef oranındaki odalara ekleyin. Görüntülenen ET oranı 50'ye bir olacaktır, görüntüleme yazılımını, her biri üç dakikada bir, konum başına 300 kare ile dört kuyuda görüntü toplayacak şekilde ayarlayın ve TMRM ve Pico Green için uygun filtre setlerini kullanarak alıntı yapın. Tüm görüntüler toplandıktan sonra, burada yayınlanmak üzere dönüştürülmelidir.

Fiji ve Image J, loci'den bir bio format eklentisi ile kullanılır. Video dönüştürme ile ilgili daha fazla ayrıntı ekteki yazılı metinde bulunabilir. Bu videoda anlatıldığı gibi krom 51 kullanılarak hücre aracılı bir lenfo sitotoksisite veya KML testi gerçekleştirildi.

Burada gösterildiği gibi, canlı hücre görüntüleme ile hücre ölümünü değerlendirmek için x ekseninde gösterilen efektör/hedef oranı arttıkça Y ekseninde gösterilen yüzde spesifik lizis artar, fare beta hücre hattı örgüsü, kırmızı aktif otoreaktif I'de gösterilen bir mitokondriyal membran potansiyel boyası TMRM ile boyandı Dört CD sekiz pozitif T hücresi piko yeşili ile yeşil kalıyordu ve iki hücre tipi birlikte kültürlendi burada görülebileceği gibi 50'ye bir E ila T oranında. 400 dakikalık bir süre boyunca kademeli olarak dağılan bir mitokondriyal zar potansiyeli örün, ancak yalnızca bir kontrol deneyi olarak yeşil AI dört T hücresi ile etkileşime girdiğimiz kümelerde. Lekeli örgü bir hücre, burada görülebileceği gibi, T hücrelerinde pico yeşillikleri ile boyanmış MHC uyumsuz insan sarsıntısı ile kültürlendi.

Örgü bir hücre, 400 dakika boyunca mitokondriyal membran potansiyelini koruyabildi. Devre hücreleri örgü bir küme ile etkileşime girmedi ve bu nedenle öldürmeye neden olmadı. Bir kez ustalaştı.

Bu teknik, hücre hazırlığı dahil olmak üzere yaklaşık beş gün sürer. Bu videoyu izledikten sonra, Otoreaktif T hücresi tarafından saldırı altındayken beta hücre zarı potansiyelinin nasıl değiştiğini iyi anlamış olmalısınız. Radyoizotoplarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun eğitimin alınması ve önlem alınması gerektiğini unutmayın.