Name: Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Öğrenin, sitotoksik CD8+ T hücrelerinin pankreatik beta hücre ölümünü nasıl tetiklediğini. Krom-51 salınımı ve canlı hücre görüntüleme yöntemleriyle tip 1 diyabet patogenezini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmanın yanı sıra, National Institutes of Health DK074656 ve AI56374 (CEM) hibe Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. Hücrelerin hazırlanması <ol><li> Hedef hücre kültürü: Kültür fare beta hücre hatları, NIT-1 ve NIT-4,% 10 FBS,% 0.02 BSA, Non-esansiyel amino asit, 15mm Hepes, 16.5mm ile desteklenmiş DMEM önceden açıklanan 1,2 oldu Glocose ve Penisilin / Streptomisin. 5x10 4 hücre düz bir alt 96-kuyu kültür plaka 51 Cr etiketleme, tohum hücreleri / 200 ul kültür ortamı iyi. Mikroskopi deneyler, 500 ul kültür ortamı oda başına 5x10 4 8-iyi Lab-Tak II odacıklı coverglass tohum hücreleri ve sitotoksisite deneyleri kullanarak 48 saat önce büyümek için izin. </li><li> Kontrol T hücre hattı kültürü: (ATCC, CD3 + insan lenfosit hücre hattı) negatif kontrol olarak Jurkat hücre hattı kullanın. RPMI1640 Kültür Jurkat hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 2 mM L-glutamin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat, 10 mM Hepes ve 1.0 mM sodyum piruvat. </li></ol> 2. Efektör otoreaktif CD8 + T hücrelerinin toplanması ve aktivasyonu NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] ve NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME) satın alınan ve fare tesiste yetiştirilen. NOD-AI4a çiftleşmelerin F1 hibrit döl NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] 3-5 yaş hafta diyabet gelişecektir. Tüm fareler spesifik patojen free tesisleri içinde yer alır ve ilgili kurum Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. <ol><li> CO 2 kullanarak 3-4 hafta eski NOD-AI4a / b fareler Euthanize. </li><li> Farelerden alınan dalak toplayın. Ötenazi fareler etanol sprey ile hazırlanan ve cerrahi kaputun altında açıldı. Dalak çıkarılır ve hemen buz HBSS tampon konur. </li><li> 7 ml'lik cam homojenizatör kullanarak dalak hücrelerinin toplayın. İki üç dalak her 5 ml soğuk HBSS koymak ve 7 ml'lik cam homojenizatör ile homojenize edilir. Homojenat 4 1200rpm 5 dakika boyunca toplanan ve santrifüj ° C Sorvall RT7 + santrifüj kullanarak. Hücre pelletleri toplanır. </li><li> Hipotonik çözüm tedavisi kullanarak kırmızı kan hücrelerinin çıkarın. Peletler, 5 dakika buz üzerinde çözüm / dalak 5 ml hipotonik ile tedavi edilir, daha sonra eşit miktarda HBSS ekleyerek nötralize. Yukarıdaki gibi, santrifüj hücreleri toplayın ve 50 ml HBSS tekrar süspansiyon haline getirin. Askıya alınan hücrelerin hücre süzgecinden Pass ve TrypanBlue boyama ile hemasitometre kullanarak saymak. </li><li> Hücreleri aktive. 5x10 6 / ml ve etkinleştirmek RPMI1640 0.1 mcM AI4 mimotope (amino asit dizilimi YFIENYLEL) ve 25 U / ml, IL-2 ile 3 günlük kültür kullanarak yeniden süspanse hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 2 mM L-glutamin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat, 10 mM HEPES ve 1.0 mM sodyum piruvat. </li></ol> 3. 51 Cr serbest tahlil KML incelemek için <ol><li> Etiket hedef hücreleri: 1 ile 3 saat μCi / iyi ve kültür hücreleri hedef ve kültür ortamı ile 3 kere yıkayın 51 Cr ekleyin. </li><li> Son hacmi, her bir kuyunun eklendi böylece adım 2.5 'te belirtilen RPMI 1640 orta efektör hücreleri Askıya Alma 200 ul. </li><li> Etiketli hedef hücreleri son yıkamadan sonra, oranları: (T E) hedef, istenilen efektör hedef hücre kültürleri efektör hücreleri aktive eklemek. 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:01, 20:01 ve 50:1 T oranları: Biz genellikle E kullanabilirsiniz. </li><li> Kendiliğinden bir parçalama kontrolü gibi hareket etmek, hedef hücrelerin 6 kuyu taze değiştirilmiş RPMI 1640 orta (2.5 adım) ekleyin. </li><li> 16 saat boyunca ko-kültür efektör ve hedef hücreleri. </li><li> 6x50 mm Kireç Cam tüpler supernatant toplayın </li><li> 100μl% 2 SDS ekleme ve hafifçe birkaç kez pipetleme hücreleri Lyse. </li><li> 6x50 mm Kireç Cam tüpler başka bir dizi hücre lizat toplayın. </li><li> Temiz H 2 O kuyuların bir kez yıkayın ve hücre lizat tüplerine yıkama ekleyin. </li><li> Bir gama sayacı kullanarak süpernatantlar ve hücre lizatları güvenin. </li><li> Özel lizis aşağıdaki gibi hesaplayın: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Denklem 1"></li></ol> 4. Canlı hücre görüntüleme için hücrelerin boyanması En sık kullanılan mitokondriyal membran potansiyeli boyalar arasında TMRM en mitokondriyal toksisite sergiler. Bu nedenle 3, biz bu canlı hücre görüntüleme çalışmaları için TMRM seçin. <ol><li> DMSO ve mağaza -20 ° C'de 40 mM stok TMRM çözüm hazırlayın [25 nM] NIT-1 hücre kültürü 1 için tüm takviyeleri ile fenol kırmızısı DMEM taze çalışma çözüm olun. </li><li> 37 ° 30 dakika TMRM 25 nM hedef NIT-1 hücreleri leke ° C </li><li> Boya 4 denge dağılımı korumak için TMRM 5 nM içeren taze medya ile medya değiştirin. </li><li> Hematocytometer kullanarak aktive efektör AI4 T hücreleri güvenin. </li><li> 1 ul / ml Picogreen için aktif efektör AI4 T hücreleri LekeOda sıcaklığında 5 dakika ve fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı 3 kez ile yıkayın. </li></ol> 5. Canlı hücre görüntüleme kullanılarak değerlendirilmesi T lenfosit aracılı beta hücre ölümü <ol><li> Odacıklı coverglass Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop aşamasında lekeli NIT hücreleri ile monte edin. Dremmel ve gaz odacıklı cam etheline oksit ile sterilize sekmesini çıkarın. Aşamada, sıcaklık 37 ° ° C ve% 5 CO 2 nem ile. Olan bir canlı hücre görüntüleme odası ile donatılmıştır . </li><li> Aktive ekleyin ve farklı E belirlenen odalarına lekeli T hücreleri: T oranları. </li><li> Lekeli Jurkat hücrelerinin aynı sayıda kontrol odalarına eklendi. </li></ol> 6. Canlı hücre görüntüler Edinme Mikroskop, bize tekrar tekrar deney süresi boyunca otomatik olarak aynı ya da farklı odalarına farklı yerlerde görüntüler elde etmek için izin motorlu bir sahne ile donatılmıştır. <ol><li> 63x yağ objektif lens kullanarak, konumu başına 300 kare olmak üzere toplam her 3 dakikada bir aralıkta görüntüleri alır. </li><li> Emisyon 565-619 nm eksitasyon dalga uzunluğu 543 nm ve filtre seti kullanarak TMRM boyama Algılama </li><li> Algılama bir uyarım 488 nm ve emisyon 500-630 nm için bir filtre kullanılarak Picogreen boyama. Video Zeiss LSM yazılımı kullanılarak oluşturuldu. </li></ol> 7. Yayın için video dönüştürme <ol><li> Zeiss LSM yazılımı kullanarak, sıkıştırılmamış bir AVI formatında film dosyası oluşturabilirsiniz. </li><li> Video yayınlanan biçime dönüştürmek için, video, yazılım paketi Fiji (içine ithal <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), bir ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> lokusların (Bioformats eklentisi kullanarak) dağıtım, <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Yeşil ve kırmızı sinyaller ve kare hızı, animasyon seçenekler menüsünü kullanarak, 2 kare / saniye olarak ayarlandı dengesi, parlaklık ve kontrast ayarlarını ayarlayın. </li><li> Sıkıştırılmamış bir AVI dosyası olarak 512 x 512 piksel ve ihracat için video kırpın. </li><li> Yazılım Quicktime 7 (Apple bilgisayar, Cupertino, CA) bu AVI dosyasını açın ve sıkıştırmak ve açık video dosyası formatı H264/MPEG-4 1200 kbs / ikinci ihracat. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: <ol><li> 51 Cr KML testinin bir temsilci sonucudur. Hedef oranı (X ekseni) artar: Şekil 1, yüzde belirli lizis (Y ekseni) Efektör artar bir KML testinin temsili bir sonuç göstermektedir. Hedef hücrelerin immünyetmezligi NOD izole birincil adacıklar Rag1-/ - fareler ve 51 Cr etiketli. NOD.AI4α / β transgenik fareler izole dalak ve yukarıdaki 2. adımda açıklandığı gibi aktive edilir. Hedefler ve etkileyiciler 16 saat için ortak kültüre edildi. Yüzde özel lizis yukarıda adım 3.11 'de açıklandığı gibi hesaplanır. </li><li> T hücre-aracılı beta hücre mitokondrial membran potansiyeli dağılımı iki temsilci (pozitif ve negatif) sonuçları sunulmaktadır. Hücreler lekeli ve reaksiyonlar adımları 4, 5 ve 6 yukarıda anlatıldığı gibi kayıt altına alınır, video dosyaları, 7. adımda olarak oluşturulur. Video 1: fare beta hücre hattı NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli boya TMRM (Kırmızı) boyandı. T oranı 50:1: Aktive, otoreaktif CD8 + T hücre AI4 (Picogreen Vitray yeşil) E bu NIT-1 hücreleri ile ortak kültüre edildi. NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli 400 dakika süresince yavaş yavaş dağıldı, ancak sadece AI4 T hücreleri ile etkileşim içinde olan kümeler. Video 2: Bir kontrol deneyi olarak, NIT-1 hücreleri TMRM ve E Picogreen lekeli Jurkat hücreleri ile ko-kültür ile boyandı: T oranı 50:1. Jurkat hücreleri MHC uyumsuz bir insan T hücre hattı. NIT-1 hücreleri co-inkübasyon süresi 400 dakika tüm süresi boyunca mitokondrial membran potansiyeli sürdürdü. Jurkat hücreleri NIT-1 kümeleri ile etkileşim yoktu ve bu nedenle öldürülmesi neden yok. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1 KML Temsilcisi sonucu immünyetmezligi NOD.Rag1 / izole hedef hücreleri birincil adacıklar olarak kullanarak fare ve dalak NOD.AI4α / β transgenik fareler. Hedefler ve etkileyiciler 16 saat için ortak kültüre edildi. Yüzde özel lizis Efektör olarak artar: Hedef oranını yükseltir. Video 1 Mouse beta hücre hattı NIT-1 mitokondriyal membran potansiyeli boya TMRM (Kırmızı) boyandı. Aktive otoreaktif CD8 + T hücre AI4 (Vitray Picogreen ile yeşil) bu NIT-1 E hücreleri ile ortak kültüre edildi: 50:1 T oranı. NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli dissipaTed kademeli olarak 400 dakikalık süre içinde, ama sadece yeşil AI4 T hücreleri ile etkileşim içinde olan kümeler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">videosunu izlemek için tıklayın</a> . Video 2 Video 1 ve ko-kültür Picogreen lekeli insan T hücre hattı Jurkat açıklandığı gibi NIT-1 hücreleri aynı boyandı. NIT-1 hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyeli 400 dakika süre düşünülmüş koruyabilmiştir. NIT-1 kümeleri Jurkat hücreleri etkileşim yoktu ve bu nedenle öldürülmesi neden yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">videosunu izlemek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Üniversitesi Florida Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Sitotoksik T hücre aracılı beta hücre ölümü T1D 5 ana patofizyolojisi. 51 Cr sürümü kullanarak KML testleri bize efektör-hedef yanıt 6 derecesini incelemek için izin verir. Ancak, ayrıntılı bir süreç ve T hücre-aracılı beta hücre ölümü yolları hala tam olarak anlaşılmış değildir. Mitokondri, beta hücre fonksiyonu ve ölüm 7 için kritik olduğundan, görsel KML sırasında mitokondrial değişiklikler üzerine odaklanmıştır . Mitokondrial zar potansiyelini dağılımı apoptozis 8</su...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl rodamin Metil Ester (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> amino asit dizilimi: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Ar-Ge </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM Non-Essential Amino Asitler </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> İkizler burcu </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol kırmızı ücretsiz DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 İnkübatör </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Hücre kültürü için steril Kept </td></tr><tr><td> Biyolojik güvenlik kabini </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Tek kullanımlık kültür tüpleri, 6x50 mm Kireç Cam </td><td> Balıkçı </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gama Sayıcı </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Otomatik Gama Sayıcı </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> EKK 510 Meta Konfokal </td><td> Motorlu sahne ve canlı hücre odasına </td></tr><tr><td> Pipet (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borular (Sarı) </td><td> Balıkçı </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Dik Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Fare </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Fare </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β F1 fareler </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF hayvan tesisi yetiştirilen </td></tr></tbody></table>

sitotoksik t lenfositler beta hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Tip 1 diyabet (T1D) T hücre aracılı otoimmün hastalık. Patogenezinde sırasında, hastaların insülin üretimi kayıp olarak T hücreleri tarafından pankreas beta hücrelerinin yıkımını muhtemelen bu sonuç, giderek daha insulinopenic hale gelir. T1D gelişimi sırasında beta hücre ölüm mekanizmaları anlamak, bu hastalık için etkili bir çare üretmek için anlayışlar sağlayacaktır. Hücre aracılı lenfositotoksisite (KML) testlerin tarihsel hedef hücreleri etiket radyonüklid Krom 51 (51 Cr) kullanılır. Bu hedefler daha sonra efektör hücreleri maruz kalan ve 51 Cr hedef hücrelerden serbest bırakılması lenfosit aracılı hücre ölümü bir göstergesi olarak okunur . 51 Cr azalmış serbest hücre ölümü sonucu inhibitörleri. Efektör hücreler olarak, CD8 aktive otoreaktif klonal nüfus + AI4 T hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri için bir fare stok transgenik izole Sitotoksik T lenfositler (CTL) kullanılır. Aktif AI4 T hücreleri 16 saat boyunca 51 Cr etiketli hedef NIT hücreleri birlikte kültür, serbest bırakılması 51 Cr belirli lizis hesaplamak için kaydedildi Mitokondri, enerji üretimi, sinyal transdüksiyon düzenlenmesi ve apoptosis gibi birçok önemli fizyolojik olaylar, katılırlar. T1D gelişimi sırasında beta hücre mitokondrial fonksiyonel değişiklikler çalışma, bir araştırma roman alanıdır. Mitokondriyal membran potansiyeli boya tetramethyl rodamin Metil Ester (TMRM) ve konfokal mikroskobik canlı hücre görüntüleme kullanarak, beta hücre hattı NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli zaman içinde izlenmektedir. Görüntüleme çalışmaları için, efektör AI4 T hücreleri floresan nükleer boyanma boya Picogreen etiketli. NIT-1 ve T hücreleri odacıklı coverglass ortak kültür ve canlı bir hücre odası ile donatılmış mikroskop aşamasında üzerine monte edilmiş, 37 kontrol edildi ° C,% 5 CO 2 ve nemlendirilmelidir. Bu deneyler sırasında görüntüleri her küme her 3 dakikada bir 400 dakika alındı. 400 dakika boyunca, biz AI4 T hücreleri bağlı NIT-1 hücre kümeleri mitokondrial membran potansiyeli dağılımı görülmektedir. NIT-1 hücreleri MHC ile birlikte kültüre edildi eşzamanlı kontrol deneyde yanlış uyumlu insan lenfosit Jurkat hücreleri, mitokondriyal membran potansiyeli bozulmadan kalabilmiş. Bu teknik, sitotoksik lenfosit, sitokinler, veya diğer sitotoksik reaktifler saldırı altında hücreleri mitokondrial membran potansiyeli gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir.

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Tip 1 diyabet (T1D), T hücresi aracılı bir otoimmün hastalıktır. Patogenez sırasında, insülin ... nedeniyle hastalar giderek daha insülinopenik hale gelir.

Tip 1 diyabet, insülin salgılayan pankreas beta hücrelerinin otoreaktif T hücreleri tarafından yok edildiği bir otoimmün hastalıktır. Süreçte yer alan mekanizmaların anlaşılması, bu hastalık için etkili bir tedavi geliştirilmesine yönelik içgörüler sağlayacaktır. Burada, pankreas beta hücrelerinin cd sekiz pozitif T-hücreleri aracılığıyla in vitro yıkımını gözlemlemek için iki yöntem; kromyum 51 tabanlı hücre aracılı lenfosit sitotoksisite veya CML testi ve her iki yöntem için görsel bir CML testi gösterilmektedir.Bir CML deneyi gerçekleştirmek için önce fare dalaklarından CD8 pozitif T efektör hücreleri hazırlanır; Kn1 veya Kn4 hedef beta hücreleri kromyum 51 ile işaretlenir ve efektör hücrelerle birlikte kültürlenir. Hedef beta hücreleri öldüğünde, kromyum 51 serbest kalır. Ardından süpernatanlar ve hücre lizatları toplanır ve hücre ölümünün boyutunu belirten radyoaktivite seviyeleri bir gama sayacı kullanılarak ölçülür. Görsel bir CML deneyi gerçekleştirmek için Kn1 ve Kn4 hedef beta hücreleri mitokondriyal potansiyel boyası TM RM ile, efektör hücreler ise pico green ile işaretlenir.Hücreler birleştirilir ve mitokondriyal membran potansiyelinin dağılmasıyla belirtilen hücre ölüm hızını incelemek için canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirilir. Bu analiz yönteminin kromiyum salınım analizi gibi geleneksel analiz yöntemlerine göre temel avantajı, beta hücre ölümünü gerçek zamanlı olarak gözlemleyebilmemizdir. Ek avantajlar arasında, CD8 T hücresi aracılı beta hücre ölümünün temas bağımlı olup olmadığını belirleme yeteneği yer alır; ayrıca bu analiz, beta hücre ölümü yollarını haritalamak için floresan indikatörler kullanılarak genişletilebilir.Bu yöntem, sitotoksik T hücrelerinin rol oynadığı herhangi bir hastalığın patogenezine ilişkin temel soruları yanıtlayabilir. Mitokondriyal fonksiyon hem beta hücresi sağkalımı hem de fizyolojisi için temel olduğundan, bu tekniğin etkileri tedaviye ve muhtemelen tanıya kadar uzanmaktadır. Bu prosedürü Jing Chen ve ben göstereceğiz.Bu gösterimde kullanılan hedef hücreler, fare beta hücre hatları olan knit one ve knit four'tür; fare beta hücrelerini tanımayan ve öldürmeyen CD3+ insan lenfosit hücre hattı ise negatif kontrol olarak kullanılan efektör hücrelerdir. Efektör hücreler, üç ila dört haftalık NOD AI4 alpha beta F1 farelerinin dalaklarından elde edilen otoreaktif CD8+ T hücreleridir. Hücreleri elde etmek için, öncelikle dalakları beş mililitre buz gibi soğuk HBSS içeren yedi mililitrelik cam bir Dounce homojenizatörüne yerleştirin. Dalakları Dounce homojenizatörü kullanarak homojenize edin, ardından hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve 250 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj sonrası süpernatantı atın; ardından kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için pellet'i dalak başına beş mililitre hipotonik çözeltide yeniden süspanse edin. Buz üzerinde beş dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücre peletini buz gibi soğuk 10 mililitre HBSS ile iki kez yıkayarak santrifüjleyin. Her yıkama arasında hücre süspansiyonunu 10 mililitre buz gibi soğuk HBSS içinde yeniden süspanse edin. Ardından, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hücre sayıları belirlenmiş olsun.Tekrar santrifüjleyin, ardından hücreleri supplement eklenmiş RPMI 1640 içerisinde mililitrede 5 × 10⁶ hücre yoğunluğunda resüspande edin ve hücreleri bir T 75 flask içerisinde mililitrede 5 × 10⁶ yoğunlukta ekleyin. Son olarak, hücreleri aktive etmek için flaska sırasıyla 0,1 µM ve 25 U/mL final konsantrasyonlarında AI4 myope ve IL2 ekleyin; flaskı %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Aktive edilmiş hücreler artık ACROMIUM 51 tabanlı CML analizi veya görsel CML analizi için kullanılabilir.Buradaki hücre aracılı lenfositik sitotoksisite veya CML testi, hedef hücrelerden kromyum 51 salınımını, CD8 aracılı beta hücre ölümünün bir göstergesi olarak kullanmaktadır. Kromyum 51 ile MIN6 veya MIN4 hedef beta hücrelerini işaretlemek için, hücreleri 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna, destekleyici DMEM içeren 200 µL içerisinde 5 × 10⁴ hücre/kuyucuk yoğunluğunda ekleyerek başlayın ve 37 °C'de %5 CO2 ortamında 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kromyum 51'i ve destekleyici DMEM'i 20 µL başına 1 µCi konsantrasyona gelecek şekilde seyreltin.Ardından, her bir kuyucukta 1 micro curie sağlamak için, hedef beta hücrelerini içeren her kuyucuğa 20 µL seyreltilmiş kromyum 51 ekleyin. Plakayı %5 CO2 içeren, nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve inkübasyonun ardından üç saat boyunca bekletin. Besiyerini aspire edin ve hücreleri taze kültür besiyeri ile üç kez yıkayın.Ardından, aktive edilmiş CD8 pozitif efektör hücrelerine, her kuyucuğa eklenen toplam hacim 200 µL olacak şekilde besiyeri ekleyin. Efektör hücreleri ile hedef beta hücresi kültürlerini istenen E:T oranlarında birleştirin; spontan liz kontrolerini hazırlamak için 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 ve 0,25:1 oranları kullanılır. Hedef beta hücrelerinin bulunduğu altı kuyucuğa taze besiyeri ekleyin.Ardından plakayı inkübatöre yerleştirin ve efektör ile hedef hücreleri 16 saat boyunca ko-kültürleyin. Ertesi gün, süpernatanı altı adet 50 milimetrelik kireç cam tüpe aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra hücreleri liz etmek için plakaya 100 µL %2 SDS ekleyin ve pipetle birkaç kez nazikçe yukarı aşağı çekin.Hücre lizatını 50 mm'lik altı adet yeni kireç cam tüpe aktarın. Ardından, tüm hücre lizatının toplandığından emin olmak için her bir kuyucuğa 100 µL steril su ekleyip pipetle aşağı yukarı çekerek hücre lizatı tüplerine ekleyin ve beta hücre yıkım derecesini belirleyin. Sayımlar gerçekleştirildikten sonra, süpernatant ve lizattaki radyaktiviteyi bir gama sayıcı kullanarak ölçün.Bu denklemde gösterildiği gibi, spontan lizis Kontrol süpernatanlarındaki sayım yüzdesini, deneysel süpernatanlardaki sayım yüzdesinden çıkararak spesifik lizisi belirleyin. T-hücresi aracılı beta hücre ölümünü gerçek zamanlı olarak incelemek için; hedef ve efektör ko-kültürlerinin canlı hücre görüntülemesi ile mitokondriyal membran potansiyeli izlenir.Mikroskopiye hazırlık için, modifiye edilmiş ve sterilize edilmiş sekiz kuyucuklu oda bölmeli lamel üzerindeki hedef beta hücrelerini 5x10⁴ hücre yoğunluğunda görün. Lamları 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 48 saat boyunca büyümesini sağlayın. Deney günü, 25 nanomolar mitokondriyal membran potansiyeli boyası tetraetil romine metil ester TMRM ve fenol kırmızısı içermeyen desteklenmiş DMEM ekleyerek 30 dakika inkübe edin.Hücreler TMRM ile boyandıktan sonra, boyanın denge dağılımını korumak için besiyerini, beş nanomolar TMRM içeren taze besiyeri ile değiştirin. Ardından, bir hemositometre kullanarak aktive edilmiş efektör AI four T hücrelerini veya kontrol jerk it hücrelerini sayın ve hücreleri uygun konsantrasyonda, 15 mililitrelik konik tüplerde fenol kırmızısı içermeyen takviyeli DMEM içinde yeniden süspande edin. Daha sonra, aktive edilmiş efektör hücrelerine veya jerk it kontrol hücrelerine, mililitre başına bir mikrolitre nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde pico green ekleyin.Tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın, ardından inkübasyon sonrasında oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Fenol kırmızısı içermeyen DMEM ekleyip kısa bir süre karıştırarak ve 250 GS'de beş dakika santrifüj ederek hücreleri üç kez yıkayın. Görüntüleme için hücreleri toplamak amacıyla, odağı ayarlanabilir tablası ve 37 °C ile %5 CO2'ye sahip nemlendirilmiş canlı hücre görüntüleme hücresi ile donatılmış bir konfokal mikroskobun tablasına hazne slaytını yerleştirin.Aktive edilmiş pico green boyalı efektör hücreleri, burada değerlendirilecek olan efektör-hedef oranına göre odacıklara ekleyin. Görüntülenecek ET oranı 50'ye 1 olacaktır; görüntüleme yazılımını, her birinde üç konum olmak üzere dört kuyucuktan görüntü toplayacak şekilde, her üç dakikada bir konum başına 300 kare ile TMRM ve Pico Green için uygun filtre setlerini kullanarak eksitasyon yapacak şekilde ayarlayın. Tüm görüntüler toplandıktan sonra, yayın için buradaki formata dönüştürülmeleri gerekir.Fiji ve Image J, loci'den alınan bir bio formats eklentisi ile birlikte kullanılır. Video dönüştürmeye ilişkin daha fazla ayrıntı, beraberindeki yazılı metinde bulunabilir. Bu videoda açıklandığı üzere, kromyum 51 kullanılarak hücre aracılı lenfositotoksisite veya CML testi gerçekleştirilmiştir.Burada gösterildiği gibi, canlı hücre görüntüleme ile hücre ölümünü değerlendirmek için Y ekseninde gösterilen yüzde spesifik lizis, x ekseninde gösterilen efektör-hedef oranının artmasıyla birlikte artmaktadır; fare beta hücre hattı KNIT1, kırmızıyla gösterilen TMRM mitokondriyal membran potansiyeli boyası ile boyanmıştır, aktive edilmiş otoreaktif I4 CD8 pozitif T hücreleri ise PicoGreen ile yeşile boyanmıştır ve burada görülebileceği üzere iki hücre tipi 50:1'lik bir E:T oranında birlikte kültüre edilmiştir. KNIT1 mitokondriyal membran potansiyeli, 400 dakikalık süre boyunca kademeli olarak azalmıştır, ancak bu durum yalnızca yeşil I4 T hücreleri ile etkileşime giren kümelerde gerçekleşmiştir. Bir kontrol deneyi olarak, boyanmış KNIT1 hücreleri bunun yerine burada görülebileceği üzere PicoGreen ile boyanmış MHC uyumsuz insan Jurkat T hücreleri ile kültüre edilmiştir.Knit one hücreleri, 400 dakikalık süre boyunca mitokondriyal membran potansiyelini koruyabilmiştir. Circuit hücreleri, knit one kümeleriyle etkileşime girmemiş ve bu nedenle öldürülmeyi tetiklememiştir. Uzmanlaşıldığında.Hücre hazırlığı da dahil olmak üzere bu teknik yaklaşık beş gün sürmektedir. Bu videoyu izlediğinizde, beta hücre membran potansiyelinin autoreaktif T-hücresi saldırısı altındayken nasıl değiştiği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olacaksınız. Radyoizotoplarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini, bu prosedürü gerçekleştirirken uygun eğitimin alınması ve gerekli önlemlerin uygulanması gerektiğini unutmayın.

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Krom salınım tahlili, sitotoksik T hücresi aktivitesini tespit etmek için ortak bir tahlil, bazı sınırlamalar vardır. Bu madde, antijen spesifik CD8 T hücreleri ve insan göğüs kanseri tümör hattı ile, SKBR3 kullanarak, bir empedans dayalı bir yaklaşım hücre öldürme saptama yeteneğine için incelenmiştir.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Video, sitotoksik T lenfositlerinde veya CTL yanıtlarında immünodominansı test etmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Enjekte edilen floresan hedef hücreler, immünojenik epitoplara karşılık gelen değişen floresan sergiler. Dalak sonrası toplama ve sınıflandırma, yüksek yoğunluklu floresan hücrelerde bir azalma olduğunu ortaya koyarak CTL yanıtlarında immünodominansı doğrular.

Sitotoksik T Lenfosit Yanıtlarında İmmün Baskınlığı Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu videoda, obez olmayan diyabetik immün yetmezliği olan bir fareye nakledilen lusiferaz eksprese eden beta hücrelerini görselleştirmek için görüntüleme tabanlı bir yöntem gösterilmektedir. Diyabetik bir fareden splenositlerin eklenmesi, substrat girişinden sonra azalan lüminesans ile görsel olarak doğrulanan ilerleyici beta hücre yıkımına yol açar.

Diyabetik Splenositlerle Mücadele Edilen İmmün Yetmezliği Olan Bir Farede Transgenik Beta Hücrelerinin Görüntülenmesi

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Bu çalışma, pankreas adacıklarında sitokin kaynaklı apoptozu ve β hücreye özgü ölümü değerlendirmek için konfokal mikroskopi ile birlikte hücre ölümü ve apoptozun çok boyamalı floresan bazlı belirteçlerini kullanmaktadır. Hücre dışı uyaranlara yanıt olarak hücre ölümü ve apoptozdaki mekansal ve zamansal değişiklikleri ortaya çıkarır.

İzole Pankreas Adacık Tedavisi ve Apoptoz Ölçümü

Öğrenin, sitotoksik CD8+ T hücrelerinin pankreatik beta hücre ölümünü nasıl tetiklediğini. Krom-51 salınımı ve canlı hücre görüntüleme yöntemleriyle tip 1 diyabet patogenezini inceleyin.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Daha fazla video keşfet