Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, allojenik hematopoetik kök hücre nakli veya HSCT alıcılarına adoptif transfer için uygun olan, donör kaynaklı virüse özgü sitotoksik T lenfositlerinin veya CTL'lerin hızla üretilmesidir. Bu, öncelikle hücreleri antijen sunumuna hazırlamak için viral antigenleri kodlayan plazmidlerle dendritik hücrelerin veya dc'lerin nuklefect edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, nuklefect edilmiş dc'ler antijene özgü T hücrelerini stimüle etmek için kullanılır ve bu hücreler daha sonra gre olarak adlandırılan gaz geçirgen bir kültür cihazı içinde IL 4 ve IL 7 varlığında genişletilir.

Ardından, yedi günlük kültürden sonra, in vitro CTL ekspansiyonunu maksimum düzeyde sürdürmek amacıyla hücreler bölünür, pasajlanır ve besiyerleri yenilenir. Son olarak, 12. günde hücreler hasat edilir; saflık, potens ve güvenlik açısından test edilir ve sonraki klinik kullanımlar için kriyoprezervasyonla saklanır. Nihayetinde, hücre içi sitokin boyaması, interferon gamma üretimi ve sitotoksisite ile kanıtlandığı üzere, çoklu virüs özgüllüğüne sahip ve minimum allo-reaktivite gösteren CTL hatları üretilebilir.

Çoklu virüse özgü sitotoksik T-hücre hatlarının üretimi zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu işlem, EP Epstein-Barr virüsü ile transforme edilmiş B-hücre hatlarının ve adenoviral vektörlerin kullanımını gerektirir ve prosedür yaklaşık üç ay sürer. Yeni yöntemimiz viral vektörler kullanmamaktadır.

Hücreler kültürde minimum hücre kaybıyla eksponansiyel olarak büyürler, bu nedenle prosedür hızlı ve maliyet etkindir. Bu prosedürü gösteren kişi, laboratuvardaki klinik fellow Eureka Gerdeman'dır; IL-4 ve G-M-CSF ile desteklenmiş Cellgenic ortamında üretilen ve ardından olgunlaştırma sitokinleri içinde 24 saat boyunca olgunlaştırılan monosit kaynaklı dcs'leri, 3 mL'lik bir transfer pipeti ile nazikçe süspanse ederek toplayın. dcs'leri saymak için tripan mavisi kullanın ve ardından bunları, tüp başına en az 0,5 × 10⁶ ve en fazla 2 × 10⁶ hücre olacak şekilde üç adet 15 mL'lik tüpe aktarın.

Ardından, DCS'yi 200 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu süre zarfında, daha önce kullanılanla aynı DC maturasyon sitokin kokteyli ile takviye edilmiş altı mililitre cell genix medyumu hazırlayın ve ikişer mililitresini 12 kuyucuklu doku kültürü işlemi görmüş bir plakanın üç kuyucuğuna paylaştırın; kullanılmayan kuyucukları ikişer mililitre steril su ile doldurun. Plakayı ön ısıtma için 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.

Hücrelerin santrifüj işlemi tamamlandığında, süpernatantları aspire edin ve her tüpe, tüp başına beş mikrogram DNA olacak final konsantrasyonda ilgili DNA plazmidlerini ekleyin. Burada, IE one PP 65 kodlayan plazmid birinci tüpe, heon penton ikinci tüpe ve E BNA one LMP two BZ F1 üçüncü tüpe eklenmektedir. DCS ve DNA'yı 100 microliters nükleer transfection çözeltisi ile süspande edin.

İyice karıştırın ve karışımı NU nükleer efektör küvetlerine aktarın. Küvetleri four D nükleofektör cihazına yerleştirin. CB 150 programını seçin ve nükleofeksiyondan hemen sonra başlat düğmesine basın.

Her bir tüpe 500 µL önceden ısıtılmış CELLGENIC DC olgunlaştırma medyumu ekleyin, pipetle iki ila üç kez nazikçe aşağı yukarı çekerek hücreleri karıştırın ve nükleik asit etkilenmiş DC'leri, geri kalan 1,5 mL önceden ısıtılmış DC olgunlaştırma medyumu içeren hazırlanmış 12 kuyucuklu plakaya aktarın. Plağı 12 ila 18 saat daha inkübatöre yerleştirin, ardından nükleik asit etkilenmiş DC'leri hasat edin, sayın ve ışınlayın. Hücreleri bir kez 10 mL CTL medyumu ile yıkayın ve ardından mililitrede 3 × 10⁵ DC olacak şekilde yeniden süspande edin. Üç nükleik asit enfeksiyonunun tamamından minimum 7,5 × 10⁵ veya 2,5 mL ve maksimum 15 × 10⁵ veya 5 mL DC havuzlayın ve havuzlanmış plazmit transfekte DC'leri G Rex cihazına aktarın.

Ardından, yanıtlayıcı hücrelerin hazırlanması için cihazı inkübatöre yerleştirin. DC seçimi sonrası geriye kalan yapışmayan mononükleer hücreleri kullanın. Yanıtlayıcıları önceden ısıtılmış kültür solüsyonuna aktarın.

Hücreleri bir kez CTL mediumu ile yıkayın. Hücreleri CTL mediumu içinde süspanse edin. Hücreleri sayın ve konsantrasyonlarını mililitre başına iki x 10⁶ hücreye getirin.

15 × 10⁶ hücre veya 7,5 mL alın ve IL-4 ve IL-7 sitokinleri ile destekleyin. 7,5 mL PBMC'yi G REX'e aktarın ve biyoreaktörü, toplam hacim 30 mL olana kadar CTL medyumu ile tamamlayın. Son olarak, G REX'i inkübatöre yerleştirip altı ila yedi gün bekletin; altıncı veya yedinci günde, medyumun 10 mL'sini aspire edin.

Ardından, kalan 20 mililitre medyumu 10 mililitrelik bir pipetle karıştırın. Hücre sayısı 50 × 10⁶ hücresinden az ise, hücreleri saymak için tripan mavisi kullanın. Kültürü taze medya ve sitokinlerle yenileyin.

Eğer 50 × 10⁶ hücreden fazla varsa, hücre süspansiyonundan 10 mL'yi çıkarın, hücreleri yeni bir G rex'e aktarın ve ardından her iki G rex'i de taze CTL medyumu ve sitokinler ile besleyin; hücreleri yeterli sayıya ulaşana kadar genişletmek için dört ila altı gün daha kültüre edin, ardından hücreleri hasat edip sayın. Daha sonra, fenotipik veya fonksiyonel analizler için kullanılmayan tüm hücreleri gelecekteki kullanımlar için kriyoprezervasyonla saklayın. İnterferon gama ELISpot ile ölçüldüğünde, multisonik DNA plazmidlerinin çoklu virüse özgü T hücrelerini indüklediğini ve reaktif hücre frekansının, aynı antijenleri eksprese eden geleneksel PHU plazmidleri kullanılarak oluşturulan hatlarınkine göre daha yüksek olduğunu gösteren temsili sonuçlar.

Bu şekilde gösterildiği üzere, DC'nin PBMC'ye olan optimal oranı güçlü T hücresi stimülasyonu için önemlidir; burada bire 50 oranının, G rex içerisindeki bire 20 stimülatör/respondör oranlı CTL kültürüne kıyasla suboptimal reaktivasyon sağladığı görülmektedir; G rex kullanımı, bu şekilde görüldüğü üzere konvansiyonel 24 kuyucuklu plakalara kıyasla üstün T hücresi ekspansiyonunu destekler. Kültürlere IL-4 ve IL-7 eklenmesi, burada gösterildiği gibi, ekspande olan hücrelerin repertuvarını ve özgüllüğünü artırır; burada CMV PP65 kaynaklı HLA-A2 kısıtlı NLV peptidine karşı reaktif olan T hücrelerinin frekansı, IL-4 ve/veya IL-7 varlığında veya yokluğunda oluşturulan kültürlerde değerlendirilmiştir. Bu şekil, hızla ekspande olmuş multivirüs CTL'lerinin fenotipinin temsili bir örneğini göstermektedir; bunlar, çoğunluğu hafıza markerları olan CD45RO ve CD62L eksprese eden, CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücrelerinin karışımından oluşan poliklonal hücrelerdir. Ekspande edilen CTL'ler tüm stimüle eden antigenler için özgüllüğe sahiptir ve burada, antigen stimülasyonu sonrası interferon gama ve TNF alfa üretimini tespit etmek için yapılan hücre içi sitokin boyama ve kromyum salınım testi ile değerlendirildiği üzere polifonskiyoneldirler.

Genişletilmiş CTL'ler viral hedefleri spesifik olarak öldürebilmekte, ancak kritik bir güvenlik değerlendirmesi olan viral olmayan HLA uyumsuzluğu gösteren hedeflere karşı herhangi bir spesifik olmayan aktivite göstermemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, GNP ile uyumlu ve virüsle ilişkili hastalıkları olan hastalara adoptif transfer için uygun, çoklu virüse spesifik sitotoksik T hücre hatlarının nasıl hızlı bir şekilde üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürün basitleştirilmesi, uzmanlaşmış üretim tesislerinin ötesine geçilmesini kolaylaştıracak ve prosedürün, immün sistemi baskılanmış ve virüsle ilişkili hastalıklara karşı oldukça duyarlı olan hastalar için standart bakım uygulaması haline gelmesini sağlayacaktır.