Rekombinant Çözünür GM-CSF Reseptör kullanarak GM-CSF Antikor Nötralizasyon Kapasitesi tahmin Hücre Testi Sistemi

Bu deneyin genel amacı, G-M-C-S-F otoantikorunun nötralize etme kapasitesini nicel olarak belirleyen hücreden bağımsız bir analiz yöntemi geliştirmektir. İşleme transgenik ipekböcekleri elde ederek başlıyoruz. Rekombinant SGMR alfa üretmek için insan SGMR alfa genini aktarıyoruz ve bioTE aracılığıyla rekombinant insan G-M-C-S-F'yi işaretleme aşamasına geçiyoruz.

Ardından, G-M-C-S-F otoantikorlarının SGMR alfa'ya G-M-C-S-F bağlanmasını inhibisyonu çalışmasıyla, hücreden bağımsız sistem ile standart bir biyolojik analiz arasındaki korelasyonu değerlendiriyoruz. Elde edilen sonuçlar, serum IgG fraksiyonları ve saflaştırılmış G-M-C-S-F otoantikorları tarafından biyolojik analizdeki büyüme inhibisyonu ile hücreden bağımsız sistemdeki bağlanma inhibisyonu arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin TF one biyolojik analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, GM CSF otoantikorunun nötralize etme kapasitesini ölçmek için iyi tekrarlanabilirliğe sahip yüksek bir analiz sunmasıdır.

GM CSF otoantikorunun otoimmün primer genel prognoza neden olması nedeniyle, bu tekniğin etkileri tanıya kadar uzanmaktadır. Ayrıca, BEGF ve TNFA reseptörleri gibi rekombinant sitokin reseptörleri kullanılarak yapılan kompetitif bağlanma analizlerine de uygulanabilir. Prosedürün gösterimi, laboratuvarımdan doktora öğrencisi ano tarafından gerçekleştirilecektir. Bu pH'sız sistemi ilk olarak o geliştirmiştir.

Bu video, rekombinant SGMR alfa üretimi için kullanılan ipekböceğini göstermektedir. İlk adım, bir insan plasentası CD NA kütüphanesinden polimeraz zincir reaksiyonu ile SGMR Alpha için CDNA'nın amplifiye edilmesidir ve sonuç olarak PCR amplikonu elde edilir. Beş prime ucuna ULA virüs poli heatron'un 50 bazlık beş prime UTR dizisini eklemek için ikinci bir PCR gerçekleştirin.

Bir R RRG'yi etiketlemek için, etiketi 3' ucuna ekleyerek amplifiye edilmiş PCR R ürününü P MSG one one mg plazmidine klonlayın. Konstrukt PS GMR slash M1 one mg'yi, yardımcı vektör PHA three pig ile birlikte silkborm PNDW one suşunun yumurtalarına ko-enjekte edin. Yumurtadan çıkan G0 larvalarını 25 °C'de güvelere kadar büyütün. Ardından, kardeşler arasında veya PNDW one ile çiftleştirme yaparak, gözlerde transjenik silkbormları belirten MG FP ekspresyonuna göre G1 embriyolarını tarayın.

SGMR alfa genini içeren transgenik ipekböceği kozalarından, 500 millimolar sodyum klorür içeren fosfat tamponu ile rekombinant SGMR alfa ekstraksiyonu gerçekleştirin ve 4 °C'de 24 saat boyunca karıştırın. Numuneleri 20,000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Çökeltileri uzaklaştırmak için süpernatan sıvıyı nikel afinite kolonuna uygulayın.

Kolonu yıkayın ve proteinleri 10 milimolar ile 250 milimolar arasında doğrusal bir ole gradyanı ile dilüe edin. Saflaştırılmış SGMR alfa içeren fraksiyonları birleştirin ve fosfat tamponlu salin ile diyalize edin. Numuneleri önce PBS ile diyalize edin.

G-M-C-S-F preparasyonundan sorbitolü uzaklaştırmak için, bir mililitre 20 millimolar soğuk sodyum meta date çözeltisi ekleyin ve örneği buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Şimdi, son konsantrasyonu 15 millimolar olacak şekilde gliserol ekleyin ve 100 millimolar sodyum asetat tamponuna karşı diyaliz yapın. Devam etmek için, çözeltiye son konsantrasyonu beş millimolar olacak şekilde biotin azide ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca karıştırın.

Son olarak, reaktif olmayan materyali PBS ile diyaliz ederek uzaklaştırın ve bir mikrotitrasyon plağını, 4 °C'de gece boyunca 50 µL monoklonal anti-polyhis antikor ile kaplayın. PBST ile beş kez yıkayın. Ardından 100 µL bloklama çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Tekrar, PBST ile beş kez yıkayın. Bloklama çözeltisine 50 µL SGMR alfa ekleyin ve PBST ile beş yıkamadan sonra dört °C'de gece boyunca inkübe edin. G-M-C-S-F oto antikoru içeren örneklerden 25 µL ve ardından 25 µL biyotinile G-M-C-S-F ekleyerek dört °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

SGMR alpha G-M-C-S-F kompleksini oluşturmak için PBST ile beş kez yıkamaya devam edin ve ardından biyotinlenmiş G-M-C-S-F'ye bağlı SGMR alpha'yı tespit etmek için dört °C'de bir saat boyunca 50 µL alkalin fosfataz streptavidin ekleyin. PBST ile beş kez yıkayın, çözeltiye 50 µL kemilüminesans substratı ekleyin, oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve bir plaka okuyucu kullanarak kemilüminesans aktivitesini belirleyin. SDS-PAGE analizinde, ipekböceği kaynaklı rekombinant SDMR alpha, indirgenmeyen koşullar altında hem monomerik hem de dimerik formlarda mevcutken, indirgen koşullar altında yalnızca monomerik formda bulunur.

SGMR alpha'nın monomerler ve disülfit bağlarıyla bağlanmış dimerlerden oluşan bu rekombinant karışımı, kompetitif bir bağlanma analizinde fonksiyoneldir. Biyotinillenmiş G-M-C-S-F ile SGMR alpha kompleksi, çeşitli konsantrasyonlardaki nötralize edici antikorlar eklendiğinde disosiye olabilmesi ancak nötralize edici olmayan antikorlarla disosiye olmaması nedeniyle özgüllük göstermektedir. Ayrıca, artan G-M-C-S-F nötralize edici antikor konsantrasyonları, doz bağımlı bir şekilde, artan yüzde bağlanma inhibisyonu ile pozitif korelasyon göstermektedir.

Beklendiği üzere, G-M-C-S-F nötralize edici olmayan antikorlarının bağlanma inhibisyonu doz bağımlı değildi. Bu hücresiz sistem, G-M-C-S-F otoantikorlarının G-M-C-S-F'nin SGMR alpha'ya bağlanmasını inhibe etmesi ile hesaplanan değerler arasında r eşittir 0,988 ve P değeri 0,002 ile yakın bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bağlanma inhibisyonu, G-M-C-S-F otoantikorları ile doz bağımlı bir şekilde artmıştır.

Benzer şekilde, bağlanma inhibisyonu, importun büyüme inhibisyonu ile anlamlı derecede korelasyon göstermiştir. Bu analiz, yüzdelik bağlanma inhibisyonu için IC 50 ile serum IgG fraksiyonlarının neden olduğu yüzdelik büyüme inhibisyonu arasındaki ilişkiyle burada gösterildiği üzere, otoimmün PAP'lı hastalardan alınan serum IgG fraksiyonlarının analizinde kullanışlıdır. Ayrıca, deneyler arasındaki varyasyon katsayısı, hücre içermeyen sistemin büyüme inhibisyonu biyolojik testiyle karşılaştırıldığında bir avantaja sahip olduğunu göstermektedir.

Bir kez optimize edildiğinde, bu hücre içermeyen GM GSF reseptör ligand bağlanma analizi 38 saat içinde başarıyla tamamlanabilir. Reaksiyon sıcaklığını ve inkübasyon süresini sabit tutmayı hatırlamak önemlidir. Bu teknik, geleneksel biyolojik analizlerin yerine yeni antikor ilaçların biyolojik aktivitelerinin taranması alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır.