Rekombinant Çözünür GM-CSF Reseptör kullanarak GM-CSF Antikor Nötralizasyon Kapasitesi tahmin Hücre Testi Sistemi

Bu deneyin genel amacı, G-M-C-S-F oto antikorunun nötralize etme kapasitesini nicelendiren hücre dışı bir analiz yöntemi oluşturmaktır. İşleme transgenik ipek böcekleri elde ederek başlıyoruz. Rekombinant SGMR alfa üretmek için insan SGMR alfa genini aktarıyoruz ve bioTE aracılığıyla rekombinant insan G-M-C-S-F'nin işaretlenmesiyle devam ediyoruz.

Ardından, G-M-C-S-F otoantikorlarının SGMR alfa'ya G-M-C-S-F bağlanmasını inhibisyonu çalışmasıyla, hücresiz sistem ile standart bir biyolojik analiz arasındaki korelasyonu değerlendiriyoruz. Elde edilen sonuçlar, serum IgG fraksiyonları ve saflaştırılmış G-M-C-S-F otoantikorları tarafından biyolojik analizdeki büyüme inhibisyonu ile hücresiz sistemdeki bağlanma inhibisyonu arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin TF one biyolojik analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, GM CSF otoantikorunun nötralize edici kapasitesini ölçmek için iyi tekrarlanabilirliğe sahip yüksek bir analiz sunmasıdır.

GM CSF otoantikoru otoimmün primer genel prognoza neden olduğundan, bu tekniğin etkileri tanıya kadar uzanmaktadır. Ayrıca, BEGF ve TNFA reseptörleri gibi rekombinant sitokin reseptörlerini kullanan kompetitif bağlanma analizlerine de uygulanabilir. Prosedürün uygulaması, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan ano tarafından sunulacaktır. Bu pH'sız sistemi ilk olarak o geliştirmiştir.

Bu video, rekombinant SGMR alfa üretimi için kullanılan ipekböceğini göstermektedir. İlk adım, bir insan plasenta cDNA kütüphanesinden, polimeraz zincir reaksiyonu ile SGMR alfa için cDNA'yı amplifiye etmektir. Elde edilen PCR amplikonuna, beşinci prime ucuna ULA virüsü polihedronun 50 bazlık beş prime UTR dizisini eklemek için ikinci bir PCR gerçekleştirin.

Bir R RRG'yi etiketlemek için, etiketi üç prime ucuna eklemek amacıyla amplifiye edilmiş PCR R ürününü P MSG one one mg plazmidine klonlayın. Konstrükt PS GMR slash M1 one mg'yi, yardımcı vektör PHA three pig ile birlikte ipekböceği PNDW one suşunun yumurtalarına ko-enjekte edin. Yumurtadan çıkan G zero larvalarını 25 °C'de güvelere kadar büyütün. Ardından, kardeşler arası çiftleştirme veya PNDW one ile çiftleştirme yoluyla G one embriyolarını tarayın; gözlerdeki MG FP ekspresyonu, transgenik ipekböceklerinin varlığını göstermektedir.

SGMR alfa genini kullanarak, 500 millimolar sodyum klorür içeren fosfat tamponu ile transgenik ipekböceği kozalarından rekombinant SGMR alfa ekstraksiyonu gerçekleştirin ve dört °C'de 24 saat boyunca karıştırın. Örnekleri 20,000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Çökelekleri uzaklaştırmak için süpernatan sıvıyı bir nikel afinite kolonuna uygulayın.

Kolonu yıkayın ve proteinleri 10 millimolar ile 250 millimolar arasında lineer bir ole gradyanı ile elüye edin. Saflaştırılmış SGMR alpha içeren fraksiyonları birleştirin ve fosfat tamponlu salin ile diyalize edin. Örnekleri önce PBS ile diyalize edin.

G-M-C-S-F preparatından sorbitolü uzaklaştırmak için, bir mililitre 20 millimolar soğuk sodyum meta date çözeltisi ekleyin ve örneği buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Ardından, final konsantrasyonu 15 millimolar olacak şekilde gliserol ekleyin ve 100 millimolar sodyum asetat tamponuna karşı diyaliz yapın. Devam etmek için, çözeltiye final konsantrasyonu beş millimolar olacak şekilde biotin azide ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca karıştırın.

Son olarak, reaktif olmayan materyali PBS ilele diyaliz yoluyla uzaklaştırın; bir mikrotitrasyon plağını 50 µL monoklonal anti-polyhis antikor ile kaplayıp dört °C'de gece boyunca bekletin. PBST ile beş kez yıkayın. Ardından 100 µL bloklama çözeltisi ekleyin ve dört °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Tekrar, PBST ile beş kez yıkayın. PBST ile beş yıkamadan sonra, bloklama çözeltisine 50 µL SGMR alpha ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. G-M-C-S-F otoantikoru içeren örneklerden 25 µL ve ardından 25 µL biyotinize G-M-C-S-F ekleyip dört °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

SGMR alfa G-M-C-S-F kompleksini oluşturmak için; PBST ile beş kez yıkamaya devam edin ve ardından biotinillenmiş G-M-C-S-F'ye bağlı SGMR alfa'yı tespit etmek için 4 °C'de bir saat boyunca 50 µL alkalin fosfataz streptavidin ekleyin. PBST ile beş kez yıkayın ve çözeltiye 50 µL kemilüminesans substratı ekleyin; oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve bir plaka okuyucu kullanarak kemilüminesans aktivitesini belirleyin. SDS-PAGE analizinde, ipekböceğinden türetilen rekombinant SDMR alfa, indirgenmeyen koşullar altında hem monomerik hem de dimerik formlarda bulunurken, indirgen koşullar altında sadece monomerik formda bulunur.

SGMR alpha'nın monomerlerinden ve disülfit bağlarıyla bağlanmış dimerlerinden oluşan bu rekombinant karışım, kompetitif bağlanma analizinde fonksiyoneldir. Biyotinline G-M-C-S-F ile SGMR alpha kompleksi, çeşitli konsantrasyonlarda nötralize edici antikor eklenmesiyle ayrıştırılabilirken nötralize edici olmayan antikorlarla ayrıştırılamadığından özgünlük göstermektedir. Ayrıca, G-M-C-S-F nötralize edici antikor konsantrasyonlarının artması, doz bağımlı bir şekilde artan yüzde bağlanma inhibisyonu ile pozitif korelasyon göstermektedir.

Beklendiği üzere, nötralize edici olmayan G-M-C-S-F antikorlarının bağlanma inhibisyonu doz bağımlı değildi. Bu hücresiz sistem, G-M-C-S-F otoantikorlarının SGMR alfa'ya G-M-C-S-F bağlanmasını inhibe etmesi ile hesaplanan değerler arasında r eşittir 0,988 ve P değeri 0,002 ile yakın bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bağlanma inhibisyonu, G-M-C-S-F otoantikorları tarafından doz bağımlı bir şekilde artırılmıştır.

Benzer şekilde, bağlanma inhibisyonu, importun büyüme inhibisyonu ile anlamlı düzeyde korelasyon göstermiştir. Bu analiz, serum IgG fraksiyonlarının yüzde bağlanma inhibisyonu için IC 50 ile serum IgG fraksiyonları tarafından gerçekleştirilen yüzde büyüme inhibisyonu arasındaki ilişkiyle burada gösterildiği üzere, otoimmün PAP'lı hastalardan alınan serum IgG fraksiyonlarının analizinde kullanışlıdır. Ayrıca, deneyler arasındaki varyasyon katsayısı, hücresiz sistemin büyüme inhibisyonu biyolojik testiyle karşılaştırıldığında bir avantaja sahip olduğunu göstermektedir.

Bu hücre dışı GM GSF reseptör ligand bağlanma testi, bir kez optimize edildiğinde 38 saat içinde başarıyla tamamlanabilir. Reaksiyon sıcaklığını ve inkübasyon süresini sabit tutmak önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların geleneksel biyolojik analizler yerine yeni antikor ilaçlarının biyolojik aktivitelerini taramaları için yol açmıştır.