Name: Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin, vibratome kesit yöntemiyle Corti organının hücre mimarisini koruyarak immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme tekniğini. Bu yöntem, iç kulak dokularının yüksek çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar agaroz boncuklar kullanarak bölümleri mount öneri konfokal mikroskopi ve Dr. Jian Zhang Çocuk Araştırma Enstitüsü Imaging Core kullanımı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe DC010387 tarafından finanse edildi.

1. Iç kulakları izolasyon ve sabitleme <ol><li> Corti organı hücresel desenlendirme analizi için, euthanize uygun embriyolar veya yetişkin düzenledi. </li><li> Membranöz iç kulak içeren, otik kapsül parçalara ayır. Fare, bu embriyonik az (E) günlük 14.5 ve üstü, E0.5 vajinal fişi tespit edildiği gün embriyonlar üzerinde kolayca yapılabilir. Otik kapsül Diseksiyon orta hatta ve kafatasının açılması dekapitasyon ilk gerçekleştirilir. (Şekil 1A) her bir kulak maruz beyin çıkarın. İç kulakları sağlam kullanarak forseps (Dumont # 5, Şekil 1B gibi) kabuklu olabilir. Eğer görüntüleme Corti organı, otik kapsül ile ilişkili tüm nöronal ve bağ dokusu dikkatli çıkarılması gerekli değildir. </li><li> 4 nazik sallanan% 4 paraformaldehid daldırma (PFA) tarafından tüm iç kulakları Fix ° C 1.8 ml vidalı kapaklı Nunc Cryo-tüp şişeleri ya da diğer uygun büyüklükte konteyner geceleme. PFA çözüm, GKD 2 0 -20 ° C'de saklanan kadar gerekli taze yapılmış olmalıdır. </li><li> Ertesi gün, üç değişiklik 1X fosfat fiksatif yıkayın tuzlu su (PBS) tamponlu. Işlenmek üzere hazır olana kadar Doku ay gün kadar steril 1X PBS içinde saklanabilir. Yetişkin doku, 4% 10 EDTA (0.27 M) kirecini ° 5 gün boyunca C, durulama ve 1X PBS depolama ile izledi. </li></ol> 2. Kesme vibratome bölümleri <ol><li> 1X PBS% 4 Düşük Erime Noktası agaroz hazırlayın. Agaroz çözüm gelene kadar düşük erime noktası agaroz 1X PBS ve mikrodalga ekleyin. Çözüm üzerinde baloncuk olmadığını özen - periyodik mikrodalga ve karıştırmak için girdap çıkarmak. Kullanıma hazır olana kadar 55 ° C su banyosunda çözüm tutun. </li><li> Forseps kullanarak 1X PBS çözüm ve altındaki bir Peel-A-Way gömme kalıp konumu, iç kulak çıkarın. Pipetleyin uzakta kalıp herhangi bir aşırı 1X PBS. Bol sıvı% 4 Düşük Erime Noktası agaroz (Şekil 2A) ile doku kapağı kalıp doldurun. </li><li> Uygun düzlemde kesit için iç kulak yerleştirin. Ben kafa in situ kalmıştı sanki otik kapsül konumunu AB'ye yakınlaştırılması ve transvers düzlemde kesit Corti organı iyi kesitler elde edilmiştir. E14.5 embriyolar için görünür lateral yarı dairesel kanal (Şekil 2B), yanal görülüyor böylece yetişkin, konumu, iç kulak. Otik kapsül arka tarafında oluşan çizgi kesit (Şekil 2A, B) amaçlanan uçaktan 45 derecelik bir açıyla yaklaşık böylece iç kulak Açısı. Otik kapsül otik kapsül dorsal bölümünün üst kısmında yer alır, böylece görüntülendiğinde, koklea bazal kıvrımı alt (ok ucu, Şekil 2B) bulunan ve ön yarı dairesel kanal (Artan) olmalıdır üst (Şekil 2B). </li><li> Agaroz 30 dakika içinde RT koyacaktır. Transferi Peel-Away kalıpları ° C bölümüne hazır olana kadar 4 gömülü doku içeren. Kesit, bir sonraki güne kadar ertelendi olacaksa, 1X PBS 1X PBS batırılmış nemli kağıt havlu içeren bir kutu içinde kalıp ve mağaza agaroz kapsayacak şekilde ekleyin. </li><li> Plastik kalıp uzakta soyun. Bir jilet kullanarak, iç kulak dokusu içeren bir agaroz kutusu kesti. Düzlemine bölümünde agaroz blok aşağıya yapıştırılmış olduğu yüzey olacak blok karşı tarafında, düz ve paralel olmasını sağlamak için özen gösterin. Agaroz doku sızmak olmadığından, doku iyi desteklenmiş olacak, böylece, doku dört bir yanından gelen çok agaroz Döşeme yok. </li><li> Kesim yüzeyi blok eklemek superglue kullanın. </li><li> Vibratome 40 ila 100 mikron kalınlığında Bölüm. 1X PBS,% 0.1 TritonX-100 ile dolu bir doku kültürü çanak bölümleri kaydedin. Şekil koklear spiral aracılığıyla bir temsilci bölümünde gösterilmiştir. 2C. </li><li> Forseps doku agaroz incelemek için kullanın. Agaroz dokuya penetre olmaz, ama sadece iç kulakta dış yüzeyine yapışmış olacak. </li><li> İsterseniz, havuz, agaroz-kesitli doku doku aşırı kesme önlemek için büyük bir delik açılmasıyla pipetlemeyin kullanarak. Veya 24-iyi doku kültürü çanak çok farklı dokular üzerinde birden fazla antikor lekeleri performans, bölümleri, 16 organize edilebilir. </li></ol> 3. Antikor boyama vibratome bölümleri Antikor leke ile devam edin. Bütün montaj Süreç bölümleri, serbest yüzen bir çözüm. Aşağıda Corti organı ayağı hücrelerinin S100 işaretleyici için bir örnek antikor boyama protokolü, ancak protokol herhangi bir antikor için kullanılabilir. Tüm yıkar, aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında yapılır. <ol><li> 30 dakika boyunca çok iyi doku kültürü çanak, PBT nazik sallanan (1X PBS,% 1 sığır serum albumin,% 0.1 Triton X-100) ile serbest bölümler kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Eski çözüm ve blok serbest fl kapalı pipetleyin30 dakika, PBT + normal keçi serumu hafif sallanan (50 ul NGS / 1 ml PBT) bölümleri oating. </li><li> Eski çözüm kapalı pipetleyin ve PBT + NGS (PBT + NGS S100 1:200 dilüsyon) seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Gece 4 ° C'de nazik sallanan. </li><li> Primer antikor çözümü kapalı pipetleyin. 5 dakika 3X yıkayın. PBT, 4X, 30 dakika. PBT ile. </li><li> PBT + NGS Blok, 30 dakika. </li><li> PBT + NGS sulandırılmış floresan konjuge sekonder antikoru (keçi yetiştirilen) ile inkübe edin. 4 gece boyunca inkübe ° C, ya da bir kaç saat, RT, nazik sallanan. </li><li> Sekonder antikor çözüm kapalı pipetleyin. , 5 dakika yıkayın 3X, 4X, 30 dakika. PBT ile. </li><li> Son PBT kapalı pipetleyin yıkayın ve bir nükleer counterstain içeren sulu uygun montaj orta ile değiştirin. </li></ol> 4. Slaytlar ve konfokal mikroskobi montaj bölümleri Lamel ile kalınlığında kesitler kırma önlemek için, ayrı ayrı bölümlerin monte ederken, bir spacer mikroskop slayt ve lamel arasında takılı olmalıdır. Aşağıda kalın vibratome bölümleri montaj iki alternatif yöntemler şunlardır: <ol><li><ol type="a"><li> Bir boşluk, bir vakum gres jant doku bölümü etrafında bir kare koyarak oluşturulabilir. Böylece, lamel koyan, lamel kenarlarında vakum gres ile kapatılmış olacak. Slayt üzerine sıkı bir şekilde uyması için başparmak ile lamel kenarlarını bastırın. Vakum gres lamel tüm kenarlarında düzgün ve yeknesak mevcut ise, slayt, ters bir konfokal mikroskop kullanım için yeteri kadar mühürlü olacaktır. </li><li> Alternatif olarak, bir spacer bilinen mesh boyutu agaroz kromatografisi reçine (Affi-Gel Blue Jel, Bio-Rad) kullanılarak oluşturulabilir. Pipetleyin 1 lamel alınacaktır dört bir köşesinden her mikroskop lamı üzerine reçine ul. Reçine dört nokta ortasına pipetleyin bir doku bölümü ve montaj medya. Lamel. Eğer ters bir konfokal mikroskop kullanılarak, oje kullanılarak mikroskop lamı üzerine lamel mühür. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskopi kullanılarak boyandı vibratome dilim optik bölümleri alın. Corti organı içinde çeşitli hücre tipleri ölçmek için, tanımlanmış bir adım boyutu (1,5 ve 3 mikron arasında) z-yığını edinin. Bölüm 3.8) (adım nükleer bir boya ile karşı-lekeli olmalıdır. Görüntüler konfokal görüntü toplandıktan sonra herhangi bir bilgisayar ekranından kontrol edilebilir. Hücreler görüntüler z yığın içinde sırayla incelenir manuel olarak çekirdeklerin görünüm ve ortadan kalkması gözlemleyerek sayılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Ayağı ve Deiters hücreleri bulunan ve nükleer bir boya (Şekil 3A-F) ile zıt S100 protein, lekeli bir vibratome bölümü aracılığıyla bir temsilci konfokal z yığını. Her panel panel, 3 mikron adımları alınan konfokal görüntü konfokal görüntü vibratome bölümünde F vibratome bölüm içinde en içten elde konfokal görüntü ve panel yüzeyine yakın aldı. Corti organı morfolojisi minimal kesintiye görünür. Özellikle, ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları kırık değil. Z-yığını (Şekil 3A 3F ile) aracılığıyla ayağı hücre çekirdeğinin görünüm ve ortadan kalkması belirterek, hem iç ve dış ayağı hücre sayısı (- F numaralandırma, Şekil 3A) sayılabilir. Konfokal görüntü başına her hücre tipi sayısının az olması nedeniyle, bu yaklaşım içinde en fazla hücre tipleri Corti organı saymak için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bozulmamış, 15 hafta, yetişkin iç kulakları otik kapsül kaplı. (A) sağ otik kapsül (köşeli ayraç), beyin çıkarıldıktan sonra, kafasının içinde bir noktadan bakıldığında, kafatası kaplı. Anterior hakkı. (B) Bozulmamış, 15 hafta eski iç kafatası diseksiyonu sonra kulakları. Sol iç kulak lateral yüzeyinde görünür; sağ iç kulak medial yüzeyi görünür. Etiketler ön yarı dairesel kanal (asc), eş (koklea) ve ow (oval pencere) yerleri gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 (A) Tüm Peel-Away kalıp merkezi agaroz gömülü 15 hafta eski bir yetişkin, iç kulak . Bölümünde amaçlanan düzlemde gösterilir. Gömülü önce 15 hafta, bütün iç kulak (B) Close-up görüntü. Membranöz labirent daha net bir izlenenler böylece çevresindeki kemiğin bir kısmı uzakta diseke edilmiştir. Yanal yarı dairesel kanal (LSC), ön yarı dairesel kanal (Artan) ve koklea (co) (beyaz eğrileri) izlenmektedir. Bazal açmak ve koklea (ok ucu) bölümü (kesikli çizgi) amaçlanan düzlemde gösterilir. (C) Temsilcisi Cross-koklea yoluyla bölümü. Koklear kanal aracılığıyla bir kesit, Corti organı (oC) kutulu, stria vascularis (sv), parantez içine alınmış olan ve Reissner membran (Rm) gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 P21 at yabani tip fare Corti organı. Bir ayağı hücreleri ve Deiters görselleştirmek için Corti S100 antikor lekeli organ üzerinden 3 mikron adım boyutu, 'hücrelerinde (AF) Sıralı konfokal serisi. Serinin sonuna kadar başından itibaren iç ve dış ayağı hücreleri sayar numaralı. Kısaltmalar: İHK (iç saç hücresi), aIHC (komşu iç saç hücresi), OHC (dış saç hücresi), Bilgisayar (ayağı hücre), DC (Deiters 'hücre).

<ol><li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li>
<li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li>
<li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li>
<li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li>
<li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li>
<li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty2%2C+a+mouse+deafness+gene%2C+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li>
</ol>

Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Wisconsin IACUC Tıp Koleji tarafından belirlenen kurallara ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Immünhistokimya ve konfokal görüntüleme ile takip vibratome kesit, prosedür, minimal doku hasarı ile Corti organı görselleştirme sağlar. Açıkçası, vibratome bölümünde iç bölgelerinden alınan konfokal görüntüler sadece fiksasyon eserler ile sınırlıdır hücresel morfoloji mükemmel koruma göstermektedir. Ara sıra ayağı hücrelerinin sitoplazmik uzantıları sonları gibi hücresel kesintileri, (gösterilmemiştir) gözlemlenmesine rağmen yakın bir vibratome bölümü iki kesim yüzeyleri alınan Konfokal resimler, genellikle iç bölgeler...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Leica Blade Mikrotom Titreşimli VT1000S </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 lazer tarama konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Öğrenci Dumont # 5 Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Düşük Erime Noktası Agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way gömme kalıp </td><td> Polysciences </td><td> 18.986 veya 18646A </td><td></td></tr><tr><td> sığır serum albumini </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11.036 </td><td> 1:1000 dilüsyon </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> vakum gres </td><td> Balıkçı </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Mavi Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

corti memeli organ hücre mimarisini gelişmiş koruma için vibratome kesit

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Corti memeli organı mechanosensory saç ve nonsensory destekleyici hücrelerin yüksek sipariş hücresel bir mozaik (1,2 gözden) bu hücresel mozaik Görselleştirme Corti organı genellikle kesitli olmasını gerektirir. Özellikle, çekirdekleri dorsalde saç hücreleri ile ilgili bulunmaktadır nonsensory ayağı ve Deiters hücreleri, Corti organı kesit alma görüntülendi olamaz. Ancak, sütun ve Deiters hücreleri ince sitoplazmik süreçleri de dahil olmak üzere, memeli Corti organı hassas hücre mimarisini, standart immünohistokimyasal boyama teknikleri ile uyumlu, parafin ve cryo-kesit gibi rutin histolojik prosedürleri korumak için zordur. İşte ben konfokal mikroskobu ile takip koklea, tüm montaj bu vibratome bölümlerde immünohistokimyasal kesit vibratome oluşan basit ve sağlam bir prosedür açıklanmaktadır. Bu prosedür, fare bacak tomurcuk, zebrafish bağırsak, karaciğer, pankreas, ve kalp (seçilen örnekler için bkz: 3-6) de dahil olmak üzere birçok organı, immunhistochemical analizi için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak, bu yordamı Corti embriyo ve yetişkin farelerin 7 hem de mutant ve kontrol organları ayağı hücre sayısı hem de görüntüleme ve quantitificaton sucessful. Bu yöntem, ancak, şu anda yaygın olarak Corti memeli organı incelemek için kullanılan değildir. Corti yetişkin organ ince hücre mimarisini gelişmiş koruma sağlamak ve çeşitli hücre tipleri ölçümü için izin hem de bu işlem için potansiyel açıklanmıştır.

Immünhistokimya ve konfokal mikroskobu ile Corti organı, kesit vibratome basit bir prosedür açıklanmıştır. Bu prosedür, Corti memeli organı ince hücre mimarisini geliştirilmiş koruma sağlar ve dolayısıyla hücre tipleri doğru ölçümü için izin verir.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Memeli Corti organı, mekanosensör kıllı hücreler ve duyusal olmayan destek hücrelerinden oluşan, oldukça düzenli bir hücresel mozaiktir (1,2'de gözden geçirilmiştir). ...nın görselleştirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücresel mimariyi maksimum düzeyde koruyarak corti organını görüntülemektir. Bu, koklea başına kesilen yüzey sayısını en aza indirirken kalın kesitler elde etmek için disekte edilmiş ve fikse edilmiş iç kulakların bir vibratom ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Vibratom kesitleri daha sonra, corti organındaki çeşitli hücre tiplerinin ve hücresel yapıların tanımlanmasını sağlayan immünohistokimyasal yöntemle boyanır.Ardından, Z konumlarını belirleyen yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için kesitler monte edilir ve konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Her bir kalın Vibram kesiti boyunca, kesme işleminin neden olduğu minimum bozulma ile korti organındaki hücrelerin ve yapıların konfokal mikroskobisinin yapılmasına olanak tanıyan sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin parafin ve kriyokesit alma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kokleadaki fiziksel hasarın minimize edilmesi ve böylece korti organının hücresel mimarisinin daha iyi korunmasıdır. İç kulağı izole etmek için öncelikle, ötanazi uygulanmış yetişkin bir fareyi jilet kullanarak dekapite edin.Kafatası orta hat boyunca açılır ve ardından penset kullanılarak dikkatlice beyin çıkarılıp her iki kulak açığa çıkarılır, her iki iç kulak yerinden çıkarılır. İç kulaklar, taze %4 paraformaldehit içeren bir kriyotüp tüpüne daldırılır ve dört santigrat derecede gece boyunca hafifçe sallanır. Ertesi gün, tespit edici madde bir kez fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkanarak uzaklaştırılır ve yetişkin dokusu beş gün boyunca dört santigrat derecede %10 EDTA içinde inkübe edilerek dekalsifiye edilir.İç kulakları, işlem aşamasına gelene kadar 1x PBS içinde yıkayıp saklayın. Agarozu 1x PBS'ye ekleyip agaroz çözünene kadar mikrodalga fırında ısıtarak %4'lük düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Erimiş agarozu, kullanmaya hazır olana kadar 55 °C'lik bir su banyosunda tutun.İç kulağı pens yardımıyla PBS'den çıkarın ve soyulabilir bir gömme kalıbının tabanına yerleştirin; kalan sıvıyı pipetle uzaklaştırın ve ardından Corti organı boyunca kesitler oluşturmak için kalıbı, iç kulağı tamamen kapatacak şekilde mol ve aros ile doldurun. İç kulağı, lateral semisirküler kanal ile birlikte lateralden görülecek şekilde konumlandırın.Görünür açıda, kokleanın en arka bölgesinin oluşturduğu hattın, hedeflenen kesit düzlemiyle 45 derecelik bir açı yapacak şekilde iç kulağı konumlandırın. Agar donduktan sonra, plastik kalıbı soyarak çıkarın. Fazla agarı budamak ve bir küp oluşturmak için bir jilet kullanın.Dokunun iyi desteklenmesini sağlamak için çevresinde yeterli agar bırakıldığından emin olun. Kesit alma işlemi sırasında, agar küpünün tabanını süper yapıştırıcı kullanarak Vibram kesme yüzeyine sabitleyin; 40 ile 100 mikron kalınlığında kesitler alın ve dilimleri 0.1% Triton X 100 içeren 1x PBS dolu bir kaba toplayın. Bu işlem için pens kullanın.Aros'u doku kesitlerinden ayırarak çıkarın. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak kesitleri 0.1% Triton X 100 içeren 1x PBS ile dolu bir kaba aktarın ve antikor boyamasını bir doku kültürü plağında gerçekleştirin. Antikor boyaması tamamlandıktan sonra, doku kesitleri bir mikroskop lamına monte edilir.Kalın doku kesitlerinin ezilmesini önlemek için, lam ve lamel arasında boşluk oluşturmak amacıyla kesitin etrafına kare şeklinde bir vakum gresi tabakası yerleştirin. Doku kesitini bir mikroskop lamına aktarın. Sızdırmazlık sağlamak için lamelin kenarlarına sıkıca bastırın.Alternatif olarak, lamın yerleşeceği dört köşenin her birine, bilinen gözenek boyutuna sahip aros kromatografi reçinesinden bir mikrolitre damlatın, lamı yerleştirin ve konfokal Z-stack görüntüleme yapmadan önce kenarlarını oje ile mühürleyin. Organ of Corti kesitinin ilk görüntüsünde iç tüy hücreleri, yan yana iç tüy hücreleri, dış tüy hücreleri ve Deiters hücreleri görülmektedir. Nükleer boyama ile S100 antikor boyaması sayesinde sütun hücreleri görünür hale gelir ve sarı renkte belirir. Z-stack kesit boyunca 3 µm adımlarla ilerledikçe, çekirdeklerin ortaya çıkışı ve kayboluşu takip edilerek sütun hücrelerinin sayısı sayılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, iç kulağın vibram ile nasıl kesileceği, bu kesitlerde immünohistokimya yönteminin nasıl uygulanacağı ve ardından konfokal mikroskopi ile görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olacaksınız. Herhangi bir antikor için genel olarak uygulanabilen bu basit prosedür, organ of corti'nin hücresel organizasyonunun maksimum düzeyde korunmasını sağlar.

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Biz medial entorinal korteks (MEC) dorsal-ventral eksen korumak beyin dilimleri ile hazırlanması ve elektrofizyolojik kayıt için prosedürler açıklanmaktadır. Konumu nöral kodlama MEC içinde dorsal-ventral organizasyonu aşağıdaki Çünkü, bu işlemler navigasyon ve bellek için önemli hücresel mekanizmaların incelenmesi kolaylaştırmak.

Kemirgen Medial entorinal Korteksin dorsal-ventral Örgütü Soruşturma parasagital Dilimleri hazırlanması

Bu videoda, ince dilimler elde etmek için bütün bir fare böbreğinin vibratom kesitini gösteriyoruz. Bu dilimlenmiş doku bölümleri, daha sonraki aşağı akış analizine kadar düşük sıcaklıklarda saklanabilir.

Tüm Murin Böbreğinin Vibratom Kesiti: Murin Böbreğinin İnce Kesitlerini Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu video, bir fare vomeronazal organının (VNO) izolasyonunu ve vibratom kesiti için doku hazırlığını özetlemektedir. Bölümler, belirli bir duyusal nöron grubunun biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerini karakterize etmek için kullanılır.

Vibratom kesiti için fare vomeronazal organının hazırlanması

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Bu makalede, düzleştirilmiş teğet bölümleri memeli cortices elde etmek ve histochemical kullanarak kortikal modülleri ve immunohistokimyasal yöntemleri görselleştirmek için detaylı bir metodoloji.

Görselleştirme düzleştirilmiş memeli Cortices'deki kortikal modülleri

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Burada, fare dokularının geliştirilmesinde sitomem adı verilen özel sinyal filopodiasını tespit etmek için embriyoların fiksasyonu, immün boyama ve bölümlenmesi için optimize edilmiş bir adım adım protokol sağlanmaktadır.

Sitonem analizi için embriyonik fare dokusunun fiksasyonu

Öğrenin, vibratome kesit yöntemiyle Corti organının hücre mimarisini koruyarak immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme tekniğini. Bu yöntem, iç kulak dokularının yüksek çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Daha fazla video keşfet