Corti Memeli Organ hücre mimarisini Gelişmiş Koruma için Vibratome Kesit

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücresel mimariyi maksimum düzeyde koruyarak corti organını görüntülemektir. Bu, koklea başına kesilen yüzey sayısını en aza indirirken kalın kesitler elde etmek için disekte edilmiş ve fikse edilmiş iç kulakların bir vibratom ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Vibratom kesitleri daha sonra, corti organındaki çeşitli hücre tiplerinin ve hücresel yapıların tanımlanmasını sağlayan immünohistokimyasal yöntemle boyanır.

Ardından, Z konumlarını belirleyen yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için kesitler monte edilir ve konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Her bir kalın Vibram kesiti boyunca, kesme işleminin neden olduğu minimum bozulma ile korti organındaki hücrelerin ve yapıların konfokal mikroskobisinin yapılmasına olanak tanıyan sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin parafin ve kriyokesit alma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kokleadaki fiziksel hasarın minimize edilmesi ve böylece korti organının hücresel mimarisinin daha iyi korunmasıdır. İç kulağı izole etmek için öncelikle, ötanazi uygulanmış yetişkin bir fareyi jilet kullanarak dekapite edin.

Kafatası orta hat boyunca açılır ve ardından penset kullanılarak dikkatlice beyin çıkarılıp her iki kulak açığa çıkarılır, her iki iç kulak yerinden çıkarılır. İç kulaklar, taze %4 paraformaldehit içeren bir kriyotüp tüpüne daldırılır ve dört santigrat derecede gece boyunca hafifçe sallanır. Ertesi gün, tespit edici madde bir kez fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkanarak uzaklaştırılır ve yetişkin dokusu beş gün boyunca dört santigrat derecede %10 EDTA içinde inkübe edilerek dekalsifiye edilir.

İç kulakları, işlem aşamasına gelene kadar 1x PBS içinde yıkayıp saklayın. Agarozu 1x PBS'ye ekleyip agaroz çözünene kadar mikrodalga fırında ısıtarak %4'lük düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Erimiş agarozu, kullanmaya hazır olana kadar 55 °C'lik bir su banyosunda tutun.

İç kulağı pens yardımıyla PBS'den çıkarın ve soyulabilir bir gömme kalıbının tabanına yerleştirin; kalan sıvıyı pipetle uzaklaştırın ve ardından Corti organı boyunca kesitler oluşturmak için kalıbı, iç kulağı tamamen kapatacak şekilde mol ve aros ile doldurun. İç kulağı, lateral semisirküler kanal ile birlikte lateralden görülecek şekilde konumlandırın.

Görünür açıda, kokleanın en arka bölgesinin oluşturduğu hattın, hedeflenen kesit düzlemiyle 45 derecelik bir açı yapacak şekilde iç kulağı konumlandırın. Agar donduktan sonra, plastik kalıbı soyarak çıkarın. Fazla agarı budamak ve bir küp oluşturmak için bir jilet kullanın.

Dokunun iyi desteklenmesini sağlamak için çevresinde yeterli agar bırakıldığından emin olun. Kesit alma işlemi sırasında, agar küpünün tabanını süper yapıştırıcı kullanarak Vibram kesme yüzeyine sabitleyin; 40 ile 100 mikron kalınlığında kesitler alın ve dilimleri 0.1% Triton X 100 içeren 1x PBS dolu bir kaba toplayın. Bu işlem için pens kullanın.

Aros'u doku kesitlerinden ayırarak çıkarın. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak kesitleri 0.1% Triton X 100 içeren 1x PBS ile dolu bir kaba aktarın ve antikor boyamasını bir doku kültürü plağında gerçekleştirin. Antikor boyaması tamamlandıktan sonra, doku kesitleri bir mikroskop lamına monte edilir.

Kalın doku kesitlerinin ezilmesini önlemek için, lam ve lamel arasında boşluk oluşturmak amacıyla kesitin etrafına kare şeklinde bir vakum gresi tabakası yerleştirin. Doku kesitini bir mikroskop lamına aktarın. Sızdırmazlık sağlamak için lamelin kenarlarına sıkıca bastırın.

Alternatif olarak, lamın yerleşeceği dört köşenin her birine, bilinen gözenek boyutuna sahip aros kromatografi reçinesinden bir mikrolitre damlatın, lamı yerleştirin ve konfokal Z-stack görüntüleme yapmadan önce kenarlarını oje ile mühürleyin. Organ of Corti kesitinin ilk görüntüsünde iç tüy hücreleri, yan yana iç tüy hücreleri, dış tüy hücreleri ve Deiters hücreleri görülmektedir. Nükleer boyama ile S100 antikor boyaması sayesinde sütun hücreleri görünür hale gelir ve sarı renkte belirir. Z-stack kesit boyunca 3 µm adımlarla ilerledikçe, çekirdeklerin ortaya çıkışı ve kayboluşu takip edilerek sütun hücrelerinin sayısı sayılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, iç kulağın vibram ile nasıl kesileceği, bu kesitlerde immünohistokimya yönteminin nasıl uygulanacağı ve ardından konfokal mikroskopi ile görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olacaksınız. Herhangi bir antikor için genel olarak uygulanabilen bu basit prosedür, organ of corti'nin hücresel organizasyonunun maksimum düzeyde korunmasını sağlar.