Name: Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin farelerde Cajal ağ interstisyel hücrelerini immünofloresan mikroskopi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, gastrointestinal motilite düzenleyici ICC mimarisini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (K08CA140946, SK), (5F32CA130372, PC için), (R01CA102774 ve PB R01HL055748), Savunma Bakanlığı (YC etmek PC094302), GİST Araştırma Shuman Aile Fonu (için tarafından desteklenen PC) ve Starr Kanser Konsorsiyumu (PC, YC, CLS ve PB). Biz, Katia Manova, Ning Fan ve MSKCC Moleküler Sitoloji çekirdek tesisin Mesurh Türkekul cryosectioning ve immün yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Fare GI kanalda diseksiyonu <ol><li> Yerel IUCAC kurallar tarafından ötenazi farelerde </li><li> Strafor yüzeyinde her uzuv Pin karın yüzeyi ve% 70 etanol ile yıkayın. Diyafram pubis uzun orta hat kesi ile karın boşluğuna açın. Bir distal kalın bağırsağın distal özefagus ve ikinci bir kesme kesme ve blok tr mide anüs gastrointestinal sistem kaldırmak, küçük bir makas kullanarak duodenum ve çekum dikkatlice ligamentler kesme olun. PBS ile bir petri kabına yerleştirin GI sistem. Cımbız (Şekil 1) kullanarak mezenter parçalara ayır. Mide, ince bağırsak, kalın bağırsak, pyloru ve ileoçekal bileşke kesme ayırmak için. Her bir parçası bir beslenme iğne (eski fareler) veya künt bir iğne (genç fareler) bağlı bir 5ml şırınga kullanarak PBS ile gastrointestinal sistem lümeni durulayın. </li><li> Mezenterik sınırı boyunca aç mide, ince bağırsak ve kalın bağırsak. GI yolu her bölümü için, tüm montaj görünüm için tek ve cryosection için bir iki parça kesin. </li></ol> 2. Tüm montaj numune hazırlama ve immün <ol><li> GI kanalda her bir parçası, 4 en az 1 saat için 1.0 ml buz gibi aseton ve düzeltme örnekleri ile dolu bir 1,5 cm mikrofuge'de tüp ° C tüm parça yerleştirin. Numuneler -20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir Biz genellikle aseton örnekleri saklamak ve cyrosections hazırlamak geçin. </li><li> PBS ile örnek 2X yıkayın. PBS ile petri kabına yerleştirin örneği. Miscroscope diseksiyon altında muskularis bırakarak, bir cımbız ile bir ucunu tutarak dikkatle mukoza tabakası bir neşter ile kazıyın. </li><li> Kas farklı antikorlar ile boyanarak 5mm parçalar halinde kesilebilir. Boyama önce PBS içinde 2 günden fazla saklamayın. </li><li> Blok ve inkübasyon adımları iyi bir 24 plaka veya bir 1.5ml mikrofuge'de tüp yapılabilir. Engelleme tampon 0.5 ml (% 5 keçi serumu,% 0,1 Triton az 1 saat 4 PBS X-100 ° C) Blok. </li><li> Tampon engelleme seyreltilmiş primer antikor ile inkübe ve 4 gece döndürmek ° C Biz anti-Kiti ACK-2 sıçan, tavşan anti-Ano1 ve tüm montaj immün tavşan anti-Pgp9.5 antikorlar başarıyla kullanmıştır. </li><li> PBS ile 5 dk 2X için oda sıcaklığında rotator yıkayın. </li><li> Rotator oda sıcaklığında 2 saat süreyle bloke tampon seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Biz genellikle Alexa Fluor 488 anti-tavşan ve Alexa Fluor 594 anti-fare antikorları kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında rotator 3X PBS ile 15 dakika yıkayınız. </li><li> Mikroskopi sırasında doku yönlendirmesini sağlamak için üst slayt, serozal tarafında monte edin. Bu yönelim, lamel yüz ve bir mikroskop, slayt içine odaklanır gibi ilk karşılaşılan serozal tarafında sağlayacaktır. Biz bunu bir diseksiyon mikroskobu. Bazen, kısaca düzgün şark floresan mikroskobu altında dokuyu inceler. Kit veya Ano1 görselleştirmek için floresan mikroskobu altında, bir lamel yan ilk ICC-MY ağ karşılaşmazsınız. Sonra, aspirat PBS mümkün olduğunca olmadan tamamen kurutulması. Sabit montaj seti medya (Altın Prolong kullandığınız) 50 ul ekleyin ve doku üstüne kapak kayma yavaşça yerleştirin. -80 Gece boyunca oda sıcaklığında ve mağaza slaytlar montaj ver ayarı ° C </li><li> Mikroskobik inceleme için, Z-sürücü ile geniş bir alan mikroskobu kullanıldı. Biz ya 20X hava bir objektif (NA 0.75, planı apochromat) veya 60X yağlı objektif (NA 1.4, planı apochromat) ve 2 mm veya tüm muskularis yayılan Z kesitler 1 mikron aldı. Görüntüler daha sonra AutoQUANT deconvolution yazılımı kullanarak deconvoluted. Alternatif olarak, diğerleri benzer sonuçlar yerine konfokal mikroskobi kullandık. </li></ol> 3. Cryosection hazırlanması ve immün <ol><li> Filtre kağıdı düz aşağı GI yolu, serozal tarafında, her bir parçası yerleştirin. Doku çevresindeki filtre kağıdı kesin. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS (% 32 kullanmadan önce doğru PBS içine kapalı flakon paraformaldehid sulandırmak)% 4 paraformaldehid (PFA) filtre kağıdı üzerine koyun doku. Veya doku büyüklüğüne bağlı olarak 12 plaka, 1.5 ml mikrofuge'de tüp Fixation 6 yapılabilir yapabilirsiniz. Plakasını yapılırsa, parafilm PFA maruziyeti en aza indirmek için. Daha uzun fiksasyon kez, özellikle de anti-Kiti ACK-2 antikor, antijen maskeleme neden olabilir. </li><li> PBS içinde% 30 sakaroz PFA doku ve yer çıkarın. İzin doku 4 gece lavaboya ° C </li><li> 1 saat süreyle% 30 sükroz ve OCT 1:1 oranında doku dengelenmesi. Sonra GI sistem boylamasına ekseni cyrosections paralel olmalıdır OCT ile dolu cryomold dikey doku monte edin. Farklı genotipleri ile veya farklı tedaviler ile fareler incelendiğinde, paralel işlem sağlamak için aynı cryomold üzerine farklı farelerde doku monte etmek için yararlı olabilir. Kuru buz ve yer saklama için -80 ° C derin dondurucuda dondurun. </li><li> 10 mikron cryosections Kes-80 ° C derin dondurucu slayt ve mağaza üzerine. Biz genellikle iki bölümden slayt başına kesti. Ayrıca genellikle bir cryosection slayt H &amp; E boyama gerçekleştirin. </li><li> Immünofloresan için, ilk 15 dakika boyunca oda sıcaklığında slayt dengelenmesi. Sonra PAP kalem kullanarak doku etrafında bir daire çizin. </li><li> 1 saat süreyle bloke tampon (bütün monte immün aynı) 150 ul engelleyin. </li><li> Aspire engelleme tampon ve tampon engelleme seyreltilmiş 150 ul primer antikor ekleyin ve 4 gece inkübe ° C nemlendirilmiş bir odasında. </li><li> PBS ile 5 dk 2X yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat tampon engelleme seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Biz genellikle Alexa 488 anti-tavşan ve Alexa 594 anti-fare antikorları kullanın. </li><li> 3X PBS ile 15 dakika süreyle yıkayın. </li><li> Doku tamamen kuruyan olmadan slayt aspire. DAPI (Altın Prolong kullandığınız) # 1.5 lamel ile medya montaj sert kümesinin bir damla ekleyin. Gecelik oda sıcaklığı -80 ° C derin dondurucuda kurulum ve saklama yeri slayt. </li><li> DAPI, FITC, ve Texas Red filtre setleri kullanılarak üçlü floresan görüntüler elde. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Burada, biz, bir örnek olarak kalın bağırsak kullanır. H &amp; E sukroz leke immünofloresan için kullanılan dondurulmuş bölümünde sabit korunan bazı eserler bir referans parafin bölüm (Şekil 2), gösterir nerede dairesel ve uzunlamasına kas tabakaları ve yeşil hat demarks arasında sarı çizginin demarks myenterik pleksus arasındaki sınır mukoza ve muscularlis. Seroza mukoza cryosection incelenmesi, ilk olarak kalın yuvarlak kas (CM) tabakası tarafından takip uzunlamasına ince kas (LM) katmanı karşılaşıyoruz. CM çekirdeklerin, küçük ve yuvarlak olmalıdır LM çekirdekleri biraz uzun olmalı, böylece bölüm uzunlamasına kas ile paralel olmalıdır. LM ve CM arasında Pgp9.5 ile leke nöronlar yapılan myenterik pleksi. CM boyunca Pgp9.5 lekeleri nöronal süreçleri. Myenterik ICC ağ (ICC-MY) myenterik pleksus çevreleyen ve çok kutuplu hücreler yapılır. Longitudinal kas tabakasının içinde, bipolar hücreleri kas ile paralel olarak çalışan nadir intramüsküler ICCS (ICC-IM) vardır. Sirküler kas tabakası içinde de dairesel bir kas ile paralel ve bu kesim kesitli bipolar hücreleri olan ICC-IMs bol vardır. ICC-TPF oluşan submukozal ICC ağ muskularis ve submukoza kavşağında, düz, çok kutuplu ICCS bir ağdır. Lamel odaklanır gibi kalın bağırsak immün bütün montaj Kiti incelenmesi, bir (Figure. 3), CM ICC-IM ve ICC-SMP ağları sonra ICC-MY ağ ilk karşılaşmaya bekliyoruz. . Tüm montaj görüntüler 3 boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak ICC ağları Volumetrik ölçüsü 10 tarif edilmiştir. Geniş alan mikroskobu kullanarak, önemli bir düzlem-dışı floresan deconvolution sonra kaldırılır (Şekil 3) ham görüntüleri var. Mukoza sıyırma Eksik yüksek eşiğe neden olacaktır. ANO1 başka bir ICC'nin marker ve co-immün KİT ve ANO1 ICC boyama (Şekil 4) tam bir örtüşme gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Temsilcisi izni 13 ile yeniden basıldı, fare gastrointestinal sistem disseke. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 A) Temsilcisi H &amp; E boyama cryosections bazı büzülme eserler gösteren bölümünde anlatıldığı ve referans parafin hazırlanmış cryosections fare kalın bağırsak. Sarı hat demarks myenterik pleksus ve mavi çizgi, muskularis mukoza ayırır. B) Temsilcisi Kit (kırmızı, ACK-2) ve Pgp9.5 (yeşil) fare kalın bağırsak DAPI (mavi) counterstaining ile çift immünofloresan. LM: uzunlamasına kas CM: dairesel kas. Ölçek çubuğu 20 mm. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Temsilci Kiti (kırmızı, ACK-2) tüm montaj üç odak düzlemleri aynı alanda immünofloresan, ICC-MY LM / CM sınırında uçak, CM ICC-IM uçak ve ICC- CM / submukozaya sınırda SMP düzlemi. Ham görüntüleri ve deconvoluted görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 20 mm. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Ano1 (yeşil) ve kalın bağırsak Kiti (kırmızı, ACK-2) Temsilcisi çift immünofloresan. Ölçek çubuğu 20 mm.

<ol><li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li>
<li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal%3A+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li>
<li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li>
<li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li>
<li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li>
<li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W%2Fkit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li>
<li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumour%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li>
<li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li>
<li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+%28GIST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li>
<li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+anoctamin+1%2FTMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li>
<li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li>
<li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li>
</ol>

Cajal İnterstisyel hücreler başlangıçta gastrointestinal muskularis metilen mavisi ve gümüş kromat lekeleri kullanarak tam bir asır önce, Santiago Ramóón y Cajal ile karakterize edilmiştir. Cajal başlangıçta ICC&#39;nin nöronların akson ve dendritler anımsatan süreçlerini tabanlı düşündüm. Birçok izleyen yıl içinde, ICC biyoloji çalışma, bu KIT bir keşif değil sadece ICC ifade kadar spesifik belirteçler eksikliği tarafından sınırlı, ancak aynı zamanda onların gelişimi 6 için gereklidir. O zamandan beri, KIT immünofloresan ICC biyoloji çalışmada, yaygın olarak kullanılan ve aynı zamanda, mesane gibi diğer kontraktil organlarda ICC beğenisine yol açmıştır. Son zamanlarda, ANO1 ikinci bir güvenilir ICC belirteci olarak tespit edilmiştir. Immünofloresan kullanarak çeşitli sabitleme ve montaj teknikleri kullanarak ICC tanımlamak için son 15 yılda pek çok yayın olmuştur. Paraformaldehid ve korunan sakaroz öneki ile bizim elimizde &quot;sabit donmuş&quot; cryosections cryosectioning sonra aseton veya fiksasyonu sonrası paraformaldehid göre çalışır. Bütün bağlar için, mukozal diseksiyon aseton tespiti en sağlam sonuçlar veren bulduk. Tarihsel olarak, ACK-2 fare ICC kimlik için tercih edilen Kit antikor olmuştur. Ekstrasellüler etki tanıyan monoklonal bir sıçan ve fareler yaşamak verildiğinde ileus neden olan bir engelleme antikordur. Ancak, ACK-2 epitop paraformaldehid fiksasyon tarafından yavaş yavaş tahrip ve standart antijen alma yöntemleri ile kurtarıldı. ACK-4 epitop paraformaldehid fiksasyon daha dirençli olduğunu buldular. Morfolojisi sabit dondurulmuş blok ve bölümleri, parafin blok ve bölümler ile karşılaştırıldığında daha iyi korur ve uzun süreli arşivleme (Şekil 4) daha yumuşak. ACK-2 ya da ACK-4 ne kesitler başarıyla kullanılmaktadır. Biz, yeni bir tavşan monoklonal antikor, D13A2 GI sistem hem sabit dondurulmuş ve parafin bölümlerde son derece iyi çalıştığını karakterize var. Kit, GI yolu da bulunan melanosit, hematopoetik hücreler, germ hücreleri, ve özellikle mast hücreleri de dahil olmak üzere diğer birçok hücre tipleri, ifade edilir. Neyse ki, en mast hücreleri, muskularis mukoza ve bulunur. Çift boyama tavşan anti-Ano1 ve sıçan anti-Kit her antikor non-spesifik boyanması (Şekil 4) ortadan kaldırabilir. Ayrıca Kit ve Ano1 ICC alt sınıfları arasında göreceli bir ifade farklı görünüyor fazlalaştı. Örneğin, küçük bağırsak, Kit boyama Ano1 boyama karşılaştırılabilir ise derin kas pleksus ICC kıyasla çok daha yoğun myenterik ICC.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> rat anti-Kit antikor (klon ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> 2μg/ml az kullanın. Epitopu overfixation kaybolur. </td></tr><tr><td> rat anti-Kit antikor (klon ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> 2μg/ml az kullanın. </td></tr><tr><td> tavşan anti-KIT antikor (klon D13A2) </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 3074 </td><td> 1:100 dilüsyon kullanın. Sadece antikor parafin bölümlerde iyi çalıştığını burada listelenir. </td></tr><tr><td> tavşan anti-Pgp9.5 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etiket nöronal hücre sitoplazma. Myenterik pleksus nöronlar işaretlemek için kullanışlıdır. 1:1000 dilüsyon kullanın. </td></tr><tr><td> tavşan anti-Ano1 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> 2μg/ml az kullanın </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 keçi anti-sıçan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> 2μg/ml az kullanın </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> 2μg/ml az kullanın </td></tr><tr><td> Hayvan Besleme İğne </td><td> Balıkçı </td><td> 01-208-87 </td><td> Silikon yetişkin farelerin gastrointestinal sistem kızarma için iğne uçlu yararlı </td></tr><tr><td> Blunt İğne </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Blunt iğne ön sütten kesilen yavrular GI sistem kızarma için yararlı </td></tr><tr><td> DAPI Altın antifade reaktif uzatmak </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> DAPI ile alternatif sabit ayar montaj medya kullanabilir miyim </td></tr><tr><td> Doku-Tek Cryomold </td><td> Doku-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Doku-Tek Ekim </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> % 32 Paraformaldehit (10ml kapalı ampul) </td><td> EM Bilimler </td><td> 15714 </td><td> Açık kapalı ampul ve kullanmadan hemen önce sulandırmak için% 4 </td></tr><tr><td> Tampon Engelleme </td><td></td><td></td><td> % 5 keçi serumu,% 0.1 PBS içinde Triton X-100 </td></tr></tbody></table>

farelerde cajal (icc) ağ İnterstisyel hücreler görselleştirme

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Cajal interstisyel hücreler (ICC) peristaltizm için gerekli kendiliğinden yavaş dalgalar oluşturur ve nöronal giriş enterik sinir sistemi1 arabuluculuk gastrointestinal (Gİ) sistem mezenkimal elde edilen &quot;kalp pili hücreleri&quot;. GI yolu 2,3 muskularis ICC farklı alt tiplerinin farklı ağlar oluşturur. Bu ağlara kaybı veya yaralanma motilite bozuklukları 4 sayı ile ilişkilidir. ICC hücreleri immün ICC ağ 5,6 etiketlemek için son 15 yıldır kullanılan plazma membran ve KIT KIT reseptör tirozin kinaz ifade eder. Daha da önemlisi, normal KIT aktivite, ICC geliştirme 5,6 için gereklidir . Sık sık fonksiyon kazanç-KIT mutasyonları 7,8 limanı ICC hücreleri gastrointestinal stromal tümör (GİST), neoplastik dönüşüm . Biz son zamanlarda ETV1 ICC / GİST soy ifade bir soy-spesifik sağkalım faktörü olup, normal ICC ağ oluşumu hem de ve GİST tümörogenez 9 için gerekli bir ana transkripsiyonel regülatör olduğunu gösterdi . Biz daha KIT mutasyonları tümörigenezinde aktive işbirliği halinde olduğunu göstermektedir. Burada, farelerde ICC ağları görüntüleme yöntemleri, büyük ölçüde, daha önce yayınlanan protokolleri 10,11 açıklar . Daha yakın zamanlarda, klorür kanal anoctamin 1 (ANO1) ICC 11,12 belirli bir membran belirteci olarak karakterize edilmiştir. Çünkü plazma membran lokalizasyonu, hem proteinlerin immünofloresan ICC ağları görselleştirmek için kullanılabilir. Burada, sabit dondurulmuş cyrosections ve tüm montaj hazırlıkları ICC şebekeleri görselleştirme açıklar.

Cajal interstisyel hücreler (ICC), gastrointestinal (Gİ) sistem kalp pili hücreleri. Bunlar, düz kas hücreleri ve gastrointestinal kontraktilite düzenlemek için post-ganglion nöronal liflerdir arasındaki karmaşık ağları oluşturmaktadır. Burada, immünofloresan kesitsel yöntemler ve fare ICC ağlarının bütün montaj görselleştirme sunuyoruz.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

Cajal interstisyel hücreleri (ICC), gastrointestinal (Gİ) kanalın spontan yavaş dalgalar üreten, mezenkimal kökenli "pacemaker hücreleri"dir...

Bu prosedürün genel amacı, fare gastrointestinal (GI) sistemindeki ICC ağlarını görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle tüm GI sisteminin diseke edilip izole edilmesi ve mide, ince bağırsak, sekum ve kalın bağırsak şeklinde ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, GI sisteminin her bir bölümü; ya tüm mount görüntüleme için önce asetonla sabitlenip ardından mukozanın uzaklaştırılmasıyla ya da kesit görüntüleme için paraformaldehit ile sabitlenip ardından gömme ve kriyoseksiyon işlemlerine tabi tutularak hazırlanır.Ardından, ICC ve diğer ilgili yapıları işaretlemek için numuneler kit ve diğer epitoplara karşı immün boyanır. Son olarak, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüler alınır. Nihayetinde, immünfloresan mikroskopi aracılığıyla farelerdeki genetik veya çevresel manipülasyonların ICC mimarisi üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, belirli sinyal ağlarının ve transkripsiyon faktörlerinin ICC ağ mimarilerini nasıl etkilediği gibi ICC alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü mukozal tabakanın yanlış soyulması ve tüm bağlama (whole mount) işleminin yanlış yönlendirilmesi, önemli ölçüde arka plan boyanmasına ve spesifik sinyal kaybına neden olacaktır. Fare gastrointestinal sisteminin diseksiyonuna başlamak için, ötanize edilmiş bir farenin uzuvlarını strafor bir yüzeye iğneleyin ve abdominal yüzeyi %70 etanol ile durulayın. Diyaframdan pubise kadar uzun bir orta hat insizyonu ile abdominal boşluğu açın.Özofagusun distal kısmından bir kesi ve kalın bağırsağın distal kısmından ikinci bir kesi yaparak, mideden anüse kadar olan tüm gastrointestinal sistemi blok halinde çıkarın. Duodenum ve mezenterdeki ligamentleri küçük bir makas kullanarak dikkatlice kesin. Gastrointestinal sistemi PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.Mideyi, ince bağırsağı ve kalın bağırsağı ayırmak için mezenteri cımbız yardımıyla sıyırarak çıkarın. Besleme iğnesi veya küt uçlu iğne takılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanarak pilorus ve ileosekal bileşke noktalarından kesin. Gastrointestinal sistemin her bölümünün lümenini PBS ile durulayın.Mideyi, ince bağırsağı ve kalın bağırsağı mezenterik sınır boyunca açın. Her bir GI organı için, biri bütün mount görüntüleme ve diğeri kriyoseksiyonlar için olmak üzere iki parça kesin. İmmün boyamaya hazırlamak amacıyla, bütün mount örneğini kriyoseksiyon öncesinde asetonda sabitleyin.Öncelikle, örneği iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, örneği bir diseksiyon mikroskobu altında PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bir ucunu cımbızla tutarak, mukozal tabakayı bir skalpel yardımıyla dikkatlice sıyırın; muskularis tabakayı bırakarak kası, farklı antikorlarla boyamak üzere beş milimetrelik parçalara bölün.Numuneyi boyama işleminden önce 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde iki günden fazla saklamayın. Numuneyi bloklama tamponunda dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, numuneyi bloklama tamponunda seyreltilmiş primer antikorlarda inkübe edin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca rotasyona bırakın.Tüm mount boyama için CK 2 sıçan anti, kitt tavşan anti a O 1 ve tavşan anti PGP 9.5 antikorlarını başarıyla kullandık. Ertesi sabah, numuneleri nazikçe döndürerek PBS içinde beşer dakikadan iki kez yıkayın.Ardından örnekleri, bloklama tamponunda seyreltilmiş sekonder antikorlar içinde iki saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, genellikle Alexa Fluor 488 anti-rabbit ve Alexa 594 anti-rat antikorları kullanırız. Örnekleri PBS ile 15'er dakikadan toplam 3 kez yıkayın.Disseksiyon mikroskobu kullanarak, mümkün olduğunca fazla PBS'yi uzaklaştırıp örnekleri serozal yüzeyleri yukarı bakacak şekilde lamlara monte edin. Yaklaşık 50 µL sertleştirici montaj medyumu uygulayın ve üzerine bir lameli yerleştirin. Montaj medyumunun gece boyunca donmasını bekleyin ve lamları -80 °C'de saklayın.Görüntüleme ve görüntü alma işlemleri için geniş alan objektifli bir mikroskop kullanın. Bir Z sürücüsü ile, ya 20 kat hava objektifi ya da 60 kat yağ objektifi kullanarak tüm muscularis tabakasını kapsayan bir veya iki mikronluk Z kesitleri görüntüleyiniz. Görüntüler daha sonra auto quant dekonvolüsyon yazılımı kullanılarak dekonvolüye edilir.Alternatif olarak, immün boyama için kriyoseksiyonlar hazırlamak amacıyla konfokal mikroskopi kullanılabilir. Gastrointestinal sistemin her bir parçasını, serosa tarafı aşağı gelecek şekilde filtre kağıdı üzerine düz bir biçimde yerleştirin. Filtre kağıdını dokunun etrafından kesin.Dokuyu, oda sıcaklığında iki saat boyunca PBS içerisindeki %4 paraformaldehit banyosundaki filtre kağıdına yerleştirin. Daha uzun fiksasyon süreleri, özellikle a K iki anti kit antikoru için antijen maskelenmesine yol açabilir. Dokuyu PBS içerisindeki %30 sükroza aktarın ve dokunun 4 °C'de gece boyunca çökmesini bekleyin.Dokuyu, bir saat boyunca %30 sükroz ve OCT'nin bire bir oranıyla dengeleyin. Ardından dokuyu, OCT ile doldurulmuş bir kriyokalıba dikey olarak yerleştirin. Gastrointestinal (Gİ) kanalın boylamsal ekseni, kriyokesitlere paralel olmalıdır.Farklı genotiplere sahip veya farklı tedaviler uygulanmış fareler incelenirken, farklı farelerden alınan dokuların aynı kriyomoda yerleştirilmesi faydalı olabilir. Paralel işlemeyi sağlamak için modları kuru buz üzerinde dondurun ve minus 80 degrees Celsius'ta saklayın. Slaytlar üzerine 10 micron kalınlığında kriyo kesitler alın, her slayta iki kesit yerleştirin ve minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.İmmünofloresan için genellikle tek bir lam üzerinde h ve d boyaması yaparız. Öncelikle lamları 15 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin. Ardından, pap kalem kullanarak dokunun etrafına bir daire çizin.Kesitleri 150 µL bloklama tamponunda bir saat boyunca inkübe edin. Bloklama tamponunu aspire edin ve bloklama tamponunda seyreltilmiş 150 µL primer antikor ekleyerek nemlendirilmiş bir oda içerisinde dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Örnekleri beşer dakikalık iki kez PBS ile yıkadıktan sonra, bloklama tamponunda seyreltilmiş sekonder antikorlarla iki saat boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, genellikle Alexa 488 anti-tavşan ve Alexa 594 anti-sıçan antikorları kullanırız. Kesitleri, dokunun tamamen kurumasına izin vermeden, PB S ile 15'er dakikalık 3 kez yıkayın. DPI içeren bir damla hard set montaj medyumu ekleyin ve üzerine 1,5 numara bir lameller yerleştirin.dpi, fite ve Texas red filtre setlerini kullanarak örnekleri görüntülemek için lamları gece boyunca oda sıcaklığında bekletin. Kalın bağırsağı serozadan mukoza boyunca inceleyin. Önce daha ince olan longitudinal kas (LM) tabakasına, ardından daha kalın olan sirküler kas (cm) tabakasına rastlanır.Kesit, boyuna kaslara paralel ve dairesel kaslara dik olmalıdır; böylece boyuna kasların çekirdekleri bir miktar uzamış görünürken, dairesel kasların çekirdekleri küçük ve yuvarlak olmalıdır. Boyuna kaslar ile dairesel kaslar arasında, PGP 9.5 ile boyanan nöronlardan oluşan miyenterik pleksuslar bulunur. Tüm preparat incelendiğinde, dairesel kaslar boyunca boyanmış nöronal uzantılar da görülür. Lamelden odaklandığınızda, dairesel kasların I-C-C-M-Y-I-C-C-I-M ve I-C-C-S-M-P yapılarıyla karşılaşırsınız.Miyenterik ICC ağı, miyenterik pleksusu çevreler ve longitudinal kas tabakası içindeki multipolar hücrelerden oluşur. Sirküler kas tabakası içinde kasla paralel seyreden bipolar hücreler olan nadir intramüsküler ICC'ler mevcuttur. Muscularis ve submukoza birleşimindeki bu kesitte, sirküler kasla paralel seyreden bipolar hücreler olan bol miktarda ICC ims bulunur.Submukozal ICC ağı, multipolar hücrelerden oluşan düz bir ağdır. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. ICC mimarisini gözlemlemek için fare Gİ kanalının nasıl diseke edileceği ve immün boyanacağı konusunda iyi bir bilgi birikimine sahip olmanız gerekir.

visualization-of-the-interstitial-cells-of-cajal-icc-network-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Bu video, konfokal mikroskopi kullanılarak transgenik farelerde γδ intraepitelyal lenfositlerin (IEL'ler) görselleştirilmesini göstermektedir. Cerrahi prosedür, bağırsak mukozasını ve villusunu ortaya çıkarmak için bir perforasyon hattı oluşturmayı ve uzunlamasına bir kesi yapmayı içerir. Transgenik fareler, raportör proteinleri yalnızca γδ IEL'lerde eksprese eder ve izlemelerine izin verir. İntravital görüntüleme, yeşil floresan işaretli γδ IEL'lerin bağırsak epitel hücresinin bazal zarı...

Gama Delta İntraepitelyal Lenfositlerin İntravital Görüntülenmesi

Bu video, bir sıçan hipokampal bölümünde biyositin dolu bir internöronun görselleştirilmesi sürecini göstermekte ve spesifik antikorlar ve floresan mikroskobu kullanılarak nörokimyasal kimliğini vurgulamaktadır.

Sıçan hipokampal bölümünde internöronların immün boyanması

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Öğrenin farelerde Cajal ağ interstisyel hücrelerini immünofloresan mikroskopi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, gastrointestinal motilite düzenleyici ICC mimarisini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

Daha fazla video keşfet