Name: Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Öğrenin, EPR spektroskopisi ve spin tuzaklama ile hücrelerden nitrik oksit ve süperoksit radikallerinin tespitini. Bu yöntem, hastalık mekanizmalarını anlamak için reaktif türlerin güvenilir analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe RO1 HL81248 tarafından finanse edildi.

1. Sığır aort endotel hücreleri (BAEC) Kültür <ol><li> Uygun aseptik teknikler takip edildi. </li><li> 37 antibiyotik olmayan bir su banyosu, sıcak ortamda ° C. </li></ol> Not: orta 4.5 g / L D-glikoz ile fenol serbest Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) oluşur,% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve 2.5 ile desteklenmiş 4 mM L-glutamin,% 1 olmayan amino asitler, mg / L endotelyal büyüme faktörü. <ol start="3"><li> Inkübatör gelen T75 şişeyi içeren hücrelerin çıkarın ve kapağı içine yerleştirmeden önce% 70 etanol ile balonun yüzeyi temizleyin. </li><li> Bir aspiratör kullanarak eski orta çıkarın ve Dulbecco fosfat tamponu salin (DPBS) 5 ml iki kez yıkayın. </li><li> Tripsin 2 ml ekleyin ve periyodik mikroskop altında incelerken ayırmak için hücreler için 4-5 dakika bekleyin. </li><li> Orta 3 ml ekleyin ve tekrar tekrar ayrı t için bir pipet ile karıştırıno hücreleri ve hatta süspansiyon oluşturun. </li><li> 5 dakika boyunca 121 g bir 15 ml tüpü ve santrifüj ile tripsin ile orta 5 ml transfer edin. </li><li> Bir aspiratörü kullanarak süpernatantı. DPBS 5 ml ekleyin ve iyice karıştırın. 5 dakika 121g santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire ve orta 6 ml ekleyerek hücre peleti tekrar askıya. </li><li> Bir 6-kuyucuklu plak üzerinde, çok daha sonra, orta ve 1 ml ilave her bir hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir. Bir pipet kullanarak süspansiyonu karıştırın. </li><li> Plakası etiketlemek ve 37, bir gece boyunca inkübe ° C'de ve% 5 CO2. </li></ol> 2A. BAEC Hücre ile NO Algılama <ol><li> Uygun aseptik teknikler takip edildi. </li><li> Kuluçka den 6-kuyucuklu plak kaldırmak ve birinci ve ikinci orta aspire. 1 ml DPBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> 1.9 mM demir (II) sülfat heptahidrat (FeSO 4 .7 H 2 O, 0,8 mg eriterek taze hazırlamak 210 ul ekle01:07 oranında kullanılarak 1 CaCI2 ve MgCl2 ile DPBS ml) ve amonyum N-metil-D-glukamin ditiokarbamat (MGD, CaCI2 ve MgCl2 içeren 500 ul DPBS içinde 2.7 mg çözülerek taze olarak hazırlamak) arasında 210 ul . (Not:. aşırı MGD kullanılır Bu oran, geleneksel Fe 3 verim +-MGD aşırı MGD varlığında maksimize olmasından dolayı +-MGD kompleksi Fe 2 hazırlanması için kullanılan edilmiş bir ek Fe 2 stabilize etmek için çözelti içinde askorbat +-MGD NO-Fe 3 yana oluşan +-MGD endojen askorbat, hidrokinon, ya kadar olan dönüşüm verimle sistein ile +-mgd 2 NO-Fe EPR saptanabilir indirgenir gerekli değildir % 99,9 '.. Fe 2 düşük spin diamanyetik devlet + NO) düşük sıcaklık cihazın gerek kalmadan düz hücre veya kapiler tüpü kullanarak 15 algılanmasını sağlar. </li><li> Swirl edilen süspansiyon iyi ve 4.6 μ ekleyinkalsiyum iyonofor l (CAI) (1 ml DMSO içinde 1 mg eriterek 1,9 mM bir stok çözeltisi hazırlanır.) </li><li> Swirl yine çözüm ve sırayla 36 dakika ° C daha-Fe 3 NO azaltılması NO-Fe 2 +-MGD EPR tespit etmek +-MGD izin vermek için 37 de inkübe edilir. </li><li> Bir Eppendorf tüp ve EPR yassı hücreli (veya 50 ul kılcal tüp) için transfer süpernatant (425 ul) toplayın. </li><li> EPR satın parametreler şunlardır: mikrodalga frekansı: 9.8 GHz; merkezi alanı: 3427 G, modülasyon genliği: 6.0 G; süpürme genişliği: 100 G; alıcı kazancı: 1 x 10 5; mikrodalga gücü: 10 mW; taramaları toplam sayısı: 121; tarama süresi: 10 sn; ve zaman sabiti: 20 ms (Not: parametreleri tek enstrüman ve deneysel koşullar diğerine değişir bu yana, bu nedenle, sadece merkez alan, frekans ve modülasyon genliği dikkat edilmesi gereken en önemli parametrelerdir.). </li><li> Oda sıcaklığında spektrumları kaydetme ve 2-D spektrumları INTEG edildiBruker WinEPR Bilgi İşlem yazılım veya diğer veri işleme yazılımı kullanılarak düzeltilebilir arka plan gürültü ve bazal azaltmak için puan. Adduct oluşumu ölçümü için, konsantrasyon karşı sinyal yoğunluğu (veya bölge) standart araziler bir donör SNAP NO kullanarak inşa edilebilir. </li></ol> 2B. eNOS ayrılmasının Deney <ol><li> Kuluçka den 6-kuyucuklu plak kaldırmak ve ikinci kuyudan orta aspire ve 1 ml DPBS ile iki kez yıkanır. </li><li> A peroksinitrit donör, 5-amino-3-(4-morfolinil) -1,2,3-oxadiazolium klorür (SIN-1) eNOS 16 çözüme kavuşturmak için kullanıldı. 0,5 mM SIN-1 (M r 206,6 taze olarak herhangi bir Ca / Mg iyonları ile 500 ul PBS içerisinde 1 mg sin-1 çözülmesiyle hazırlanmıştır 10 mM stok çözeltisinden g / mol) ve seyreltik ila 2 ml ile DPBS 100 ul ekleme ve% 10 FBS. </li><li> 37 de 2 saat süre ile inkübe ° C'de ve% 5 CO2. </li><li> Inkübatör gelen plaka çıkarın ve DPBS iki kez yıkayın. </li><li> 210 ul ekle2,8 mM FeSO 4 0,7 H2O ve 19.6 mM 210 ul taze yukarıda belirtilen yönteme göre hazırlanan mgd. </li><li> Swirl çözüm ve 1.9 mM Cai 4.6 ul ekleyin. </li><li> Swirl yine çözüm ve 36 dakika 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> Bir Eppendorf tüp ve EPR düz hücre transferi (425 ul) süpernatant toplayın. </li><li> EPR satın parametreler şunlardır: mikrodalga frekansı: 9.8 GHz; merkezi alanı: 3427 G, modülasyon genliği: 6 G; süpürme genişliği: 100 G; alıcı kazancı: 1 x 10 5; mikrodalga gücü: 10 mW; taramaları toplam sayısı: 121; tarama süresi: 10 sn; ve sabit süresi: 20 ms. </li><li> Spektrumları kaydedin ve 2-B spektrumları yukarıda belirtildiği gibi düzeltilmiş arka plan gürültü ve bazal azaltmak için entegre edildi. </li></ol> 3. O 2 tespiti • - polimorfonükleer nötrofiller den (PMN) <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 17, insan nötrofil kan örneği ile izole edildi. </li><li> Dietilentriamin-pentaasetik asit (DTPA) 0.1 mM içeren PBS içinde 1 M * DMPO bir stok çözelti yapmak. DMPO 25-29 bir erime noktasına sahiptir ° C de bir cam şişeye (Not sıvı DMPO (yoğunluk ~ 1.02 g / ml 25 ° C) Pipeti daha kullanışlı hale getirir: saf DMPO beri tartım için plastik şişeleri kullanmayın ) plastik ile reaksiyona girer. Dondurulmuş DMPO flakon (: DMPO bozulabilir olarak sıcak su tüketmemek Not) üzerine ılık su çalıştırarak eritebilir. </li><li> O zamandan beri yüksek saflıkta DMPO (&gt;% 99) kullanılması önemlidir ticari olarak mevcut sıkma tuzakları bazı paramanyetik safsızlıklar içerir, ve bu yüzden, sadece tek başına DMPO çözeltisi EPR tayfı (bu durumda, 10 mM) çalıştırmak için zaruridir. Bu arka plan sinyali (Şekil 3A bakınız) bellidir önemlidir. </li><li> DMSO içinde forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) bir stok çözelti (1 mg / ml) hazırlamak. 10 mikrogram / ml PBS içinde çözüm seyreltilmesiyle alikotları olun. </li><li> Bir 1 'de.5 ml Eppendorf tüpüne, ek olarak, sırası takip ederek 0,6 ml'lik toplam hacmi, bir solüsyon hazırlanır: PMN ml başına 10 ~ 6 hücreleri, D-glükoz (1 mg / ml) ve albumin (1 mg / ml), 10 mM DMPO ve PMA ile 0,2 mg / ml. (Not: PMA radikal aktivatörü ve son olarak ilave edilmelidir). </li><li> EPR yassı hücreli çözüm aktarın. </li><li> EPR satın parametreleri Mikrodalga frekansı: 9.8 GHz; merkezi alanı: 3486 G, modülasyon genliği: 0.5 G; süpürme genişliği: 100 G; alıcı kazancı: 5 x 10 5; taramaları toplam sayısı: 10; tarama süresi: 30 s ; mikrodalga gücü: 20 mW; ve zaman sabiti: 81 ms. Adduct oluşumu ölçümü için, konsantrasyon karşı sinyal yoğunluğu (veya bölge) standart araziler gibi TEMPO veya 3-karboksilik asit-PROXYL olarak istikrarlı nitroxides kullanarak inşa edilebilir. </li></ol> DMPO kullanımına * önemli not: düz bir hücre kullanılarak, tek bir hücre yoğunluğu artırır ve böylece sinyali artan edebilirSpin adduct ama O 2 'nin yarı ömrü yoğunluğu • - DMPO of adduct DMPO-OH parçalanmasına neden olan (t 1/2 ~ 1 dak) kısa. DMPO t ​​1/2 ~ 8 ve sırasıyla 14 dakika olan artan adükt stabilite için ticari olarak temin edilebilir EMPO, BMPO ya DEPMPO aynı konsantrasyonu kullanılarak ikame edilebilir. 4. Temsilcisi Sonuçlar Spin NO radikal yakalama Fe 2 +-MGD. Şekil 2A ve 2B ile yapıldı Fe 2 hiçbir EPR sinyal göstermiyor +-MGD veya Fe 2 karışımı arka plan sinyali YOK Bu reaktiflerin kaynaklı olduğunu gösteren, CAI ile +-MGD. CAI ile uyarılması üzerine BAEC Fe 2 ile reaksiyona girerek hangi NO bültenleri spin katkısı, NO-Fe 2 +-MGD oluşturmak için +-MGD, ve aşırı yarılma sabiti (hfsc) N = 12.66 G değeri ve karakteristik üçlü sinyali gösteriyor g = 2.040 g-faktörü. (Şekil 2C). Hfsc değeri NIEHS EPR Yazılım veritabanı web sitesinden indirilebilir WINSIM simülasyon programı kullanılarak belirlendi. Deneysel hfsc NO-Fe-2 + MGD adükt için bir N = 12,70 ve G = 2,041 g, 18 literatürde değeri ile tutarlıdır. Benzer şekilde, BAEC üzerine SIN-1 etkisi Şekil 2B'de gösterildiği gibi ayrılmasının nedeni eNOS üretimi NO indirilir. Algılama - DMPO sıkma tuzağı O 2 • için kullanılmıştır. Spin tuzak paramanyetik pislik olduğunu onaylayan Şekil 3A gösterildiği gibi tek başına DMPO bir sinyal vermedi. Şekil 3B DMPO spektrumu ve PMN sadece ve benzer şekilde, DMPO neden olmaz düşündüren saptanabilir sinyal yok Enzim NADPH oksidaz aktivasyonu. Şekil 3C PMA ile PMN stimülasyonu üzerine gözlemlenen EPR sinyali gösterir. Bu sinyal için bir değer hfsc N = 14,71 G, bir &amp; olarak belirlenmiştirbeta;-H = 11,40 G ve bir γ-H = 1.25 g, ve bir N = 14.3 G, bir β-H = 11.7 G ve bir γ-H literatürde değerleri DMPO-O için = 1.3 g 19 ile tutarlıdır 2 H adükt. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. EPR Spin hapsi kullanarak nötrofiller ve BAEC gelen radikallerin tespiti için akış çizelgesi. (A) PMNs'nin DMPO ve PMA ile karıştırılmış ve ortaya çıkan karışım verilerini elde etme için bir düz EPR hücre aktarılır. (B) BAEC bir plaka üzerinde yetiştirilir ve DPBS ile yıkandı. Spin tuzak Fe (MGD) 2 CAI ile birlikte eklendi. Çözeltisi iyice karıştırılır ve inkübe edildi. Karışım EPR veri toplama için bir EPR düz hücreler nakledildi. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> B'den NO Şekil 2. EPR tespitiAEC. Fe 2 (A) Spectrum +-MGD sadece (B) +-MGD + CAI sadece Fe 2 Spektrum. (C) Fe 2 NO hapsi kaynaklanan Üçüz spektrumu +-MGD kullanarak hücrelerin CAI-uyarılmış. (D) nedeniyle 0,5 mM hücrelerinin SIN-1 tedaviye NO üretimindeki düşüş gösteren Spectrum. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Aktif hale gelen nötrofiller DMPO-O 2 H Şekil 3. EPR algılama. 10 mM DMPO sadece (A) Spektrumu. (B) 10 mM DMPO varlığında başına PMN Spektrumu. (C) PMN Spektrumu 10 mM DMPO varlığında PMA ile aktive.

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Oxygen%2C+Gene+Expression%2C+and+Cellular+Function%22">Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function</a>. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants%3A+Molecules%2C+medicines%2C+and+myths%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li>
<li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgnarro%2C+LJ+%22Editor+Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Pathobiology%22">Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).</li>
<li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li>
<li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase%3A+the+influence+of+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical%3A+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28DEPMPO%29%3A+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li>
<li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3%2C4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide%3A+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28BocMPO%29%3A+kinetics+and+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Perkin+Trans%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent%2C+MGD%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li>
<li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li>
<li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+%28SIN-1%29%3A+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Model%22%5BJournal%5D)">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li>
<li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li>
<li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates%3A+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li>
<li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-%28Diethoxyphosphoryl%29-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide%3A+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li>
<li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins%3A+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate%3A+Synthesis+and+spin+trapping+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li>
<li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li>
<li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization%2C+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li>
<li>Kim, S. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix%5B4%5Dpyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion%3A+Theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

EPR Spin hapsi serbest radikaller ve niceleme tanımlamak için biyomedikal uygulamalarda geniş bir istihdam edilmiştir. Sıkma bindirme derece hassas nM den böylece biyolojik sistemler uygulama için uygun hale uM arasında değişen konsantrasyonlarda radikalleri saptayabilir. Paramanyetik katkısı, NO-Fe 2 +-MGD, oluşumu EPR ile NO algılama temelidir. ~ Oranında 10 6 M -1 s -1 NO hızla 18 Fe 2 +-MGD tepki. NO-Fe 2 +-MGD adduct uzun bir yarı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Fenol ücretsiz DMEM Yüksek glukoz 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Olmayan Esansiyel Amino asitler </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> Endotelyal büyüme faktörü </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> Cai </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> A-23187 </td><td> DMSO içinde eritilir </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo Laboratuvarları </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 215.422-250G </td><td> Ca ve Mg ile birlikte, PBS içerisinde çözünmesi </td></tr><tr><td> MGD </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> Ca 2 + ve Mg 2 ile PBS içinde eritilir + </td></tr><tr><td> BAEC hücreleri </td><td> Hücre Sistemleri </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CaCI2 ve MgCl2 ile DPBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol miristat asetat-(PMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 79.346-1MG </td><td></td></tr></tbody></table>

nitrik oksit ve hücreler arası elektron paramanyetik rezonans spektroskopisi ile süperoksit radikal anyon tespiti spin tuzakları kullanarak

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Düşük konsantrasyonlarda reaktif nitrojen / oksijen türlerinin (ROS / RNS) sinyalizasyon, hücre fonksiyonunu düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir ve bağışıklık yanıtı ancak düzenlenmemiş konsantrasyonlarda hücre canlılığı 1, 2 için zararlıdır. Canlı sistemlerde ROS üretimi düzenleyen endojen ve diyet antioksidan savunma mekanizmaları ile büyürken, ROS normal oksijen metabolizmasının yan ürünleri doğal olarak sürekli olarak üretilir ve protein fonksiyon kaybı, DNA bölünme veya lipid sonuçlanan biyomoleküllere oksidatif hasara neden olabilir peroksidasyonu 3 ve sonuçta hücre hasarına ya da ölüme yol açan 4 oksidatif stres. Süperoksit radikal anyonu (O 2 • -) gibi peroksinitrit ve radikal hidroksil gibi biyolojik sistemler mevcut olduğu bilinmektedir en çok oksitleyici türler bazı önemli öncüsüdür. O 2 kuşak • - dolayısıyla oksidatif patlama ilk işareti işaret ve its algılama ve / veya biyolojik sistemler sekestrasyon önemlidir. Bu gösteri de, O 2 • - polimorfonükleer nötrofiller (PMN) elde edildi. Forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile kemotaktik uyarılması yoluyla, PMN O 2 • üretir - nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz 5 aktivasyonu yoluyla. Üç izoformları gelir nitrik oksit (NO) sentaz, indüklenebilen-, nöronal-ve endotel-NOS veya iNOS, nNOS ve eNOS, sırasıyla, NO 6 üretmek için, NADPH ile, L-sitrulin, L-arjininin dönüşüm katalize olarak . Burada, endotel hücrelerinden NO oluşturulur. Oksidatif stres koşulları altında, örneğin eNOS O 2 • NO üreten geçiş yapabilirsiniz - Heme 7 veya co-faktör, tetrahidrobiyopterin (BH 4) 8 oksidasyonu neden olduğuna inanılan ayrılmasının adı verilen bir süreç içinde. Sadece birkaç vardırancak biyolojik sistemlerde serbest radikallerin saptanması için güvenilir yöntemler özgüllük ve duyarlılığı ile sınırlıdır. Sıkma bindirme yaygın olarak serbest radikallerin belirlenmesi için kullanılan ve elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopi ile tespit edilebilir bir kalıcı sıkma adükt oluşturan bir spin tuzağı bir radikal ilavesiyle reaksiyon kapsamaktadır. Çeşitli radikal adducts oluşturulmakta radikalleri tespit etmek ve radikal üretiminin 9 doğasına ve kinetik hakkında bilgi zenginliği sağlayabilir kullanılabilir ayırt edici spektrumu sergilemesi. Siklik nitrones, 5,5-dimetil-pirolin-N-oksit, DMPO 10, fosforil-ikameli DEPMPO 11 ve ester-ikameli, EMPO 12 ve 13 BMPO, yaygın olarak dönme tuzağı olarak kullanılan edilmiştir - ikinci dönme adduct - tuzakları O 2 • için Uzun yarılanma ömrü sergileyerek. Demir (II)-N-metil-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) 2 &lt;Alt /&gt; genel adükt oluşumu ve sıkma adükt 14 arasında yüksek stabilite yüksek oranlı NO bağlı olarak yakalamak için kullanılır.

Elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopisi demir (II)-N-metil-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) kullanılarak, insan nötrofil gelen sığır aort endotelyal hücreler ve süperoksit anyon radikal nitrik oksit tespit etmek için kullanılmıştır<sub&gt; 2</sub&gt; Ve 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-oksit, sırasıyla, DMPO,.

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Düşük konsantrasyonlardaki reaktif azot/oksijen türleri (RNS/ROS), hücre fonksiyonunun, sinyalleşmenin ve bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ancak...

Ben Frederick Dina, Ohio State Üniversitesi'nde farmakoloji doçentiyim. Bu gösterimde, EPR Spin Tuzaklama yöntemini kullanarak hücrelerden nitrik oksit ve süperoksit tespitini göstereceğiz.Reaktif oksijen ve azot türlerinin çeşitli hastalıkların gelişiminde rol oynadığı öne sürülmektedir ve bu nedenle biyolojik sistemlerde tespit edilmeleri büyük önem taşımaktadır. Biyolojik sistemlerde reaktif türlerin tespiti için yalnızca birkaç güvenilir yöntem uygulanmıştır, ancak bunlar özgünlük ve hassasiyet açısından sınırlıdır. Bununla birlikte, spin yakalama, ROS'ların tanımlanması için yaygın olarak kullanılmaktadır ve radikalin, kalıcı bir spin adukti oluşturan bir nitro spin tuzağına veya metal komplekslerine katılma reaksiyonunu içerir; bu aduktlar elektron paramanyetik rezonans spektroskopisi veya EPR ile tespit edilebilir, çeşitli radikal aduktları, üretilen radikallerin tanımlanmasında kullanılabilecek karakteristik spektrumlar sergiler ve radikal üretiminin doğası ile kinetiği hakkında zengin bilgiler sağlayabilir.Nitrik oksit sentaz, nitrik oksit üretmek için N-A-D-P-H kullanarak L-arginin'in L-sitrülin'e dönüşümünü katalize eder. Oksidatif stres koşulları altında, NOS, "uncoupli

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Spin-yakalama ESR spektroskopi, bitki antioksidan likopen, sigara dumanı, gaz-faz, serbest radikallerin temizlenmesi Pycnogenol ve üzüm çekirdeği ekstresi etkisini araştırmak için kullanılmıştır.

Serbest Radikaller Mainstream Sigara Duman algılama ve gaz faz Atma Protokolü

Nitrik oksit (NO) endojen üretimi biyolojik fonksiyonları çok çeşitli düzenler. Bu NO dayalı sinyal bozulması veya düzensizliği birçok insan hastalıkları dahil olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Yöntem NO metabolitleri insan hastalığı için yeni tanısal veya prognostik biyolojik sağlayabilir ilgili ölçmek için.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Yeni bir elektron para-manyetik rezonanstır (EPR) yöntemi, hızlı tarama EPR (RS-EPR), geleneksel bir sürekli dalga (CW) teknikten üstün ve in vivo görüntüleme için yeni alanları açar 2B spektral mekansal görüntüleme için gösterilmiştir. Sonuçlar 250 MHz'de gösterilmiş, ancak teknik herhangi bir frekansta uygulanabilir.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Bu protokol, kapsüllenmiş insan hücrelerini 72 saate kadar canlı tutmak için bir NMR biyoreaktörünün kurulumunu ve ardından zamanla çözülmüş hücre içi NMR veri toplama ve analizini açıklar. Metodoloji, hücre içi protein-ligand etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için uygulanır.

İnsan Hücrelerinde Protein-Ligand Etkileşimlerinin Yüksek Hücre Yoğunluklu Biyoreaktör Kullanarak Gerçek Zamanlı Kantitatif Hücre İçi NMR ile İzlenmesi

Burada, nitrik oksit ve biyolojik olarak ilgili türevlerini, yüksek hassasiyete sahip kemilüminesans bazlı testler kullanarak tespit etmek için protokoller sunuyoruz.

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler 

Öğrenin, EPR spektroskopisi ve spin tuzaklama ile hücrelerden nitrik oksit ve süperoksit radikallerinin tespitini. Bu yöntem, hastalık mekanizmalarını anlamak için reaktif türlerin güvenilir analizini sağlar.

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak (Video) | JoVE Journal

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Daha fazla video keşfet