Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Ben Frederick Dina, Ohio State Üniversitesi'nde farmakoloji doçentiyim. Bu gösterimde, EPR Spin Tuzaklama yöntemini kullanarak hücrelerden nitrik oksit ve süperoksit tespitini göstereceğiz.

Reaktif oksijen ve azot türlerinin çeşitli hastalıkların gelişiminde rol oynadığı bildirilmiştir, bu nedenle biyolojik sistemlerde tespit edilmeleri büyük önem taşımaktadır. Biyolojik sistemlerde reaktif türlerin tespiti için yalnızca birkaç güvenilir yöntem kullanılmıştır, ancak bunlar özgünlük ve duyarlılık açısından sınırlıdır. Öte yandan, spin yakalama yöntemi ROS'ların tanımlanmasında yaygın olarak kullanılır ve bir radikalin, kalıcı bir spin addütü oluşturan bir nitro spin tuzağına veya metal komplekslerine katılım reaksiyonunu içerir; bu addütler elektron paramanyetik rezonans spektroskopisi veya EPR ile tespit edilebilir. Çeşitli radikal addütler, üretilen radikalleri tanımlamak için kullanılabilecek karakteristik spektrumlar sergiler ve radikal üretiminin doğası ve kinetiği hakkında zengin bilgiler sağlayabilir.

Nitrik oksit sentaz, nitrik oksit üretmek için N-A-D-P-H kullanarak L-argininin L-sitrüline dönüşümünü katalize eder. Oksidatif stres koşulları altında, eNOS, "uncoupling" (ayrışma) adı verilen bir süreçle nitrik oksit üretmekten süperoksit üretimine geçebilir; bu durumun hem grubunun oksidasyonundan veya nitrik oksit regülasyonunu bozan kofaktörden kaynaklandığına inanılmaktadır. Biyolojik sistemlerde nitrik oksit regülasyonu, vazodilatasyon gibi faydalı fizyolojik fonksiyonlarla sonuçlanan hücre sinyalizasyonunda kritik bir rol oynadığı için önemlidir, ancak aşırı üretimi genellikle enflamatuar durumlarla ilişkilendirilir. Bu nedenle, biyolojik sistemlerde nitrik oksit tespiti önemlidir.

Biyolojik sistemlerdeki bir diğer önemli sinyal molekül sınıfı, nitrik oksit gibi reaktif oksijen türleridir; düşük konsantrasyonlardaki reaktif oksijen türleri hücre fonksiyonlarının, sinyalleşmenin ve bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde önemli bir rol oynarken, kontrolsüz konsantrasyonlar oksidatif strese yol açan hücresel oksidatif hasara neden olabilir. Süperoksit radikal anyonu, en önemli reaktif oksijen türlerinden biridir ve biyolojik sistemlerde var olduğu bilinen en güçlü oksitleyici türlerin bazılarının, örneğin süperoksit nitrit ve hidroksil radikalinin temel öncülüdür. Bu nedenle, biyolojik sistemlerde süperoksitin saptanması ve/veya tutulması önemlidir, çünkü oluşumu oksidatif patlamanın başlangıcından önceki ilk belirtiyi işaret eder.

Bu protokol, yazılı prosedürde açıklandığı şekilde kültürlenmiş bovine aortik endotel hücrelerini tripsin ile ayırır. Hücreleri etiketlenmiş altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve inkübasyonun ardından 37 °C'de ve %5CO2'de gece boyunca inkübe edin.

Altı kuyucuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve ilk kuyucuktaki medyumu aspire edin. Hücreleri iki kez 1 mL delcos fosfat tamponlu salin veya DPBS ile yıkayın. 0,8 mg demir sülfatı, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren 1 mL DPBS'ye ekleyerek 1,9 mM demir sülfat heptahidrat çözeltisi hazırlayın.

Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren 500 µL DPBS'ye 2,7 mg amonyum MGD ekleyerek MGD çözeltisini hazırlayın. Bir yedi molarite oranını kullanarak, taze hazırlanmış 1,9 mM demir sülfat heptahidratın 210 µL'sini ve taze hazırlanmış MGD'nin 210 µL'sini ekleyin ve oluşan süspansiyonu karıştırın. 4,6 µL kalsiyum iyon for ekleyin ve çözeltiyi pipetle yukarı aşağı çekerek tekrar karıştırın.

Ardından örneği 37 °C'de 36 dakika boyunca inkübe edin. Çöken süpernatantı bir eppendorf tüpüne toplayın. EPR kazanım parametrelerini merkez alan 34,27 gauss modülasyonu, 6 gauss genlik ve 9,8 GHz frekans olarak girin.

Parametreler bir cihazdan diğerine ve deneysel koşullara göre farklılık göstereceğinden, bu ekipmanda kullanılan diğer parametreler için lütfen metne bakınız. Süpernatantı parafin ile sızdırmaz hale getirilmiş bir EPR düz hücreye aktarın ve EPR boşluğuna yerleştirin. Deney çalıştıktan sonra, 121 tarama ve tarama başına 10,4 saniye ile yaklaşık 21 dakika boyunca spektrumları kaydedin.

Arka plan gürültüsünü azaltmak için tabanı düzeltmek ve 2D spektrumları entegre etmek amacıyla brucker WIN EPR işlemleme yazılımını kullanın. Tarama süresinin ve tarama sayısının bir deneyden diğerine farklılık gösterebileceği unutulmamalıdır. Ayrıca, taban düzeltme yöntemleri de kullanılan yazılıma göre değişiklik gösterebilir.

Enos ayrıştırmasına başlamak için, altı kuyucuklu plakanın ikinci kuyucuğundaki besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 1 mL DPBS ile iki kez yıkayın. Ardından, hazırlanan 0.5 mM Syn one çözeltisinden 100 µL ekleyin ve hacmi %10 FBS içeren DPBS ile 2 mL'ye tamamlayın; hücreleri 37 °C ve %5 CO2 koşullarında iki saat boyunca inkübe edin.

Hücreleri iki kez DPBS ile yıkayın. Ardından, taze hazırlanmış 210 µL 2,8 mM demir sülfat heptahidrat ve önceki prosedüre göre taze hazırlanmış 210 µL 19,6 mM MGD ekleyin. Sonrasında, 4,6 µL 1,9 mM kalsiyum iyonfor ekleyin ve çözeltiyi tekrar karıştırın.

Daha önce yapıldığı gibi, hücreleri 37 °C'de 36 dakika boyunca inkübe edin. 36 dakika sonra, ependorf tüpünde çöken süpernatantı toplayın ve bir EPR düz hücreye aktarın. Kazanım sonrası, daha önce kullanılan aynı kazanım parametrelerini kullanarak EPR spektrumlarını kaydedin.

Bu Protokol başlamadan önce verileri aynı Şekilde işleyin. Bir molar DMPO stok çözeltisi ve 0,1 milimolar DTPA içeren PBS hazırlayın. Ardından, dört tarafından 12'lik bir miligram/mililitre çözelti hazırlayın.

DMSO içinde Myra State 13 asetatı veya PMA'yı, 1 mg/mL D glukoz ve 1 mg/mL albümin içeren bir eppendorf tüpünde PBS ile 10 µg/mL'ye seyrelterek birer mililitrelik PMA stok çözeltisi alikotları hazırlayın. 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpünde pipetleme yaparak mililitrede 5 ila 6 milyon PMN hücresi hazırlayın. Yaklaşık 1,6 × 10⁶ PMN hücresi, 10 mM DMPO ve 0,2 µg/mL PMA içeren, son hacmi 60 µL olan bir karışım hazırlayın.

Bu deneyde, Bruker ESP 300 X band spektrometresi kullanacağız. Çözeltiyi bir EPR düz hücreye aktarın, ardından düz hücreyi EPR boşluğuna yerleştirin. EPR veri toplama parametrelerini; merkez alan 3, 486 gauss, modülasyon genliği 0,5 gauss ve frekans 9,8 gigahertz olarak giriniz.

Parametreler cihazdan cihaza ve deney koşullarına göre farklılık göstereceğinden, lütfen bu deneyde kullanılan diğer parametreler için metne bakarak spektrumları edinin. Bu gösterimde, iki farklı spin tuzağı olan demir MGD ve DNPO kullanarak nitrik oksit ve süperoksit radikallerinin tespitini gösteriyoruz.

Endotel hücrelerin kalsiyum iyonforu ile stimülasyonunun nitrik oksit ürettiğini ve tedavi ile görülen bir perinitrit donörünün nitrik oksit üretimini azaltabileceğini gösteriyoruz. Ancak, bir nitro spin tuzağı varlığında PMA ile nötrofillerin stimülasyonu, başlangıçta oluşan süperoksit adda'nın instabilitesi nedeniyle S oksit yerine bir hidroksil radikali ADDA verir. Demir MGD nitrozlar tarafından spin yakalama mekanizmaları temel olarak aynı olsa da, demir MGD'ye nitrik oksit eklenmesi hızlı bir reaksiyon hızına sahiptir ve demir MGD nitrik oksit add formu oldukça stabildir.

Aslında, EPR sinyal yoğunluğunda önemli bir azalma olmadan EPR spektrumunun daha sonra elde edilebilmesi için çözelti -80 °C'de dondurulabilir. Öte yandan, nitro spin tuzağı kullanılarak oksit tespiti yavaştır. Bu durum, nitrik oksit tespiti için kullanılan karşıt demir MGD dört yöntemine kıyasla daha yüksek spin tuzağı konsantrasyonları gerektirmektedir.

Süperoksit adükt formunu başarıyla tespit etmek için, bu videoda artık göstermediğimiz çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştır. Örneğin, düz hücre kullanımı, daha yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle daha iyi süperoksit adükt sinyal yoğunluğu sağlayabilir. Bu konuyla ilgili olarak ilgili metne başvurmanızı öneririm.

Ayrıca, DMPO kullanmak yerine, daha kalıcı SU peroksit adüktleri sağlayabilen BMPO ve VMP gibi sertifikalı bir spin tuzağı veya fosforile Nitro DAP MPO kullanılabilir. US tespitinde spin yakalama yöntemi uygulanırken, SU peroksit adüktlerini stabilize etmek için siklodextrin kullanımı da tercih edilmiştir. SU süperoksit üretimi sonrası EP spektrumunun derhal elde edilmesi şiddetle önerilir.

Bu nedenle, demir MGD kullanılarak nitrik oksit tespiti çok daha verimlidir ve süperoksidin PR spin tuzaklamasının karşı karşıya olduğu temel zorluk, demir MGD nitrik oksit adduktunun oluşumunda gözlemlenen özelliklere ulaşmaktır. Bunlar; hızlı süperoksit reaktivitesi ve kararlı addukt oluşumudur. Süperoksite karşı hızlı reaktivite gösteren ve kararlı spin adduktları oluşturan spin tuzaklarının geliştirilmesine yönelik çalışmalar şu anda laboratuvarımızda ve diğer gruplar tarafından yürütülmektedir.