Name: Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Öğrenin, insan hematopoetik kök hücrelerini eritroid hücrelere farklılaştırma ve lentiviral aracılı TAL1 gen susturma yöntemlerini. Bu protokol, kan hastalıkları araştırmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kan örnekleri (Ottowa Hastanesi Araştırma Etik Kurulu altında elde edilen sağlamak için ex vivo eritroid farklılaşma, D. Allan ve H. Atkins (Ohri, Kanada) tavsiye L. Douay ve MC Giarratana (Université Paris VI, Fransa) teşekkür # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) eleştirel bir yazının okunması için lentiviral vektörler ve FJ Dilworth (Ohri, Kanada) sağlamak için. Bu proje MBCGP bir CIHR hibe (MOP-82.813) tarafından finanse edildi Ontario Araştırma Fonu Hesaplamalı Regulomics Eğitim Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı. MB, Kanada Araştırma Başkanı Gen İfadesi Yönetmeliği tutar.

<ol><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Kim, S. I., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+erythropoiesis%3A+emerging+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles.</a> Oncogene. 26, (2007).</li>
<li>Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocytic+maturation+in+vitro+of+murine+%28Friend%29+virus-induced+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).</li>
<li>Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid-cell-specific+properties+of+transcription+factor+GATA-1+revealed+by+phenotypic+rescue+of+a+gene-targeted+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line.</a> Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).</li>
<li>Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotential+leukemia+cell+line+%28K-562%29+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).</li>
<li>Giarratana, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).</li>
<li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li>
<li>Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+lentivirus-mediated+gene+transfer+and+sustained+transgene+expression+in+human+hematopoietic+primitive+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny.</a> Mol Ther. 6, 673-677 (2002).</li>
<li>Laurenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+and+shRNA+expression+in+resident+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo.</a> Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).</li>
<li>Palii, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genomic+targeting+of+the+transcription+factor+TAL1+in+alternate+haematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages.</a> EMBO J. 30, 494-509 (2011).</li>
<li>Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+maturation+of+human+erythroid+progenitors+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture.</a> Blood. 73, 100-103 (1989).</li>
<li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+blood+group+antigens+on+human+erythroid+cells+in+a+two+phase+liquid+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system.</a> Blood. 75, 505-511 (1990).</li>
<li>Sui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin-independent+erythrocyte+production%3A+signals+through+gp130+and+c-kit+dramatically+promote+erythropoiesis+from+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells.</a> J Exp Med. 183, 837-845 (1996).</li>
<li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor%2Ferythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li>
<li>Lindern, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li>
<li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li>
<li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li>
<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

Yöntemler bir dizi değişken derecelerde başarı ile kültür eritroid hücrelerin ayırt etmek için daha önce kullanılmıştır. Örneğin, MS-5 ko-kültür olmadan bazı protokolleri eritroid hücrelerin genişlemesi sağlar, ancak 12-17 tam olgun enükleasyon kırmızı kan hücrelerinin üretiminde etkili değildir . Diğer yöntemlerle verimli enükleasyon izin verirken, proliferasyon 18,19 pahasına. Başlangıçta Douay laboratuvar 6 tarafından geliştirilen, burada kullanılan yöntem, (genomik ve proteomik çalış...

lentiviral aracılı demonte sırasında ex vivo İnsan hematopoetik kök hücre eritropoiesis

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Eritropoiesis hücre farklılaşması incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model sistem. Eritropoezi sırasında, pluripotent yetişkin insan hematopoietik kök hücreleri (HKH&#39;lerin) oligopotent progenitörlerle taahhüt öncüleri ve olgun kırmızı kan hücreleri 1 farklılaşırlar. Bu süreç, eş zamanlı olarak, diğer hücre türleri 2 için belirli genlerin bastırma soy belirli genlerin spesifik transkripsiyon faktörleri aktive sayede gen ekspresyonu, düzeyinde büyük bir kısmı için düzenlenir. Eritropoez düzenleyen transkripsiyon faktörleri ile ilgili çalışmalar genellikle farklılaşma 3-5 aşamada, bir dereceye kadar, eritroid hücreler temsil insan ve fare hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Ancak dönüştürülmüş hücre hatları eritroid hücreler sadece kısmen taklit edebilir ve en önemlisi de bir anlaşılır son eritroid kaderi karşı birçok aşamalardan geçerek hücreler ilerleme olarak ortaya çıkan dinamik değişiklikleri incelemek için izin vermez. Bu nedenle, güncel bir sorun genomik ve proteomik deneyler gerçekleştirmek için yeterli miktarda farklılaşma çeşitli aşamalarında birincil HKH&#39;lerin ve eritroid hücrelerin nispeten homojen nüfus elde etmek için bir protokol gelişme kalır. Burada, kordon kanı, kemik iliği, veya G-CSF (leukapheresis) ile mobilize yetişkin periferik kan ya da izole edilmiştir insan hematopoietik kök / progenitör hücrelerin eritroid farklılaşma ikna etmek için bir ex vivo hücre kültürü protokolü açıklar . Başlangıçta Douay Laboratuvar 6 tarafından geliştirilen bu kültür sistemi, kemik iliği mikroçevresinin taklit etmek, mezenkimal hücreler sitokinler ve co-kültür kullanır . Bu ex vivo farklılaşması protokolü kullanarak, güçlü bir amplifikasyon eritroid progenitörlerle özel eritroid soy ve enükleasyon kırmızı kan hücrelerinin sahne için tam bir olgunlaşma yolunda farklılaşma bir indüksiyon gözlemliyoruz. Böylece, bu sistem eritroid soy boyunca hematopoietik kök hücre ilerleme olarak transkripsiyonel yönetmelik moleküler mekanizmayı incelemek için bir fırsat sağlar. Transkripsiyonel düzeyde eritropoezi incelenmesi aynı zamanda birincil eritroid hücrelerde aşırı açık veya demonte özgü faktörler yeteneği gerektirir. Bu amaçla, bölme ve bölünen hücreleri 7 hem de verimli bir enfeksiyon için izin veren bir lentivirüs-aracılı gen dağıtım sistemi kullanır . Burada biz verimli birincil insan eritroid hücrelerde transkripsiyon faktörü TAL1 demonte mümkün olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, GFP ifade lentiviral enfeksiyon% 90 yakın bir verimlilik göstermektedir. Böylece, protokolü düzenleyici transkripsiyon faktörleri ağ kontrol eritropoezi karakterizasyonu için oldukça yararlı bir sistem sağlar.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protokolü açıklanan hematopoietik kök / atalarıdır olgun insan kırmızı kan hücreleri oluşturmak için. Ayrıca biz demonte transkripsiyon faktörü TAL1 birincil eritroid hücrelerde etkili bir lentiviral teslim yöntemi açıklanmaktadır. Lentivirüs aracılı gen teslim verimliliği GFP ifade virüsler kullanılarak gösterilmiştir.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Eritropoez, hücre diferansiyasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model sistemdir. Eritropoez sırasında, pluripotent yetişkin insan hematopoetik kök hücreleri...

Bu prosedürün genel amacı, insan hematopoetik kök ve progenitör hücrelerini eritroid soy boyunca farklılaştırmak ve ex vivo eritropoez sırasında belirli bir transkripsiyon faktörünü baskılamaktır. Bu işlem, öncelikle kordon kanından, kemik iliğinden veya GCSF ile mobilize edilmiş periferik kandan CD 34 pozitif insan kök ve progenitör hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kemik iliği mikroçevresini taklit etmek için spesifik sitokinleri ve stromal hücre tabakası üzerinde ko-kültürü birleştiren dört aşamalı bir hücre kültürü prosedürü kullanarak bu hematopoetik kök hücreleri eritroid soy boyunca farklılaştırmaktır.Ardından, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne karşı bir HRNA molekülü eksprese eden lentiviral vektör partikülleri, negatif kontrol olarak scrambled bir HRA molekülü ve virüs enfeksiyonu verimliliğini kontrol etmek için GFP proteini hazırlayın. Prosedürün son adımı, farklılaşmanın belirli bir aşamasındaki primer insan eritroid hücrelerini lentiviral partiküllerle enfekte etmektir. Nihayetinde; hücre morfolojisinin, progenitörlerin koloni oluşturma kapasitesinin, hemoglobin üretiminin ve eritroid spesifik markerların FACS ile ekspresyonun

lentiviral-mediated-knockdown-during-ex-vivo-erythropoiesis-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, ölümsüzleştirilmiş hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (iHSPC'ler) stabil knockdown hücre hatları elde etmek için shRNA lentiviral vektörlerinin transdüksiyonunu gerçekleştirmek için bir yöntem gösteriyoruz.

İn Vitro iHSPC'lerde Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Yıkımı: Spesifik Gen Ekspresyonunun Yıkılması için iHSPC'lere Lentivirus Tabanlı Bir shRNA Ekspresyon Sistemi Teslimatı

Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.

Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

Eritropoezin modellenmesi, bu süreçteki aktörlerin biyolojik önemini kavramak ve farklılaşma kusurlarını hafifletebilecek yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için değerli bir şans sağlar. Burada, CD34+ hematopoietik kök ve progenitör hücreleri ex vivo olarak etkili bir şekilde ayırt etmek için basit ve güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

Öğrenin, insan hematopoetik kök hücrelerini eritroid hücrelere farklılaştırma ve lentiviral aracılı TAL1 gen susturma yöntemlerini. Bu protokol, kan hastalıkları araştırmaları için temel oluşturur.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Daha fazla video keşfet