Name: Spinal Kordonlar nörotropik Mouse Hepatit Virüs ile Etkilenmiş Fare Fare Nöral Kök Hücre Transplantasyon Cerrahi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Keşfedin, fare nöral kök hücrelerinin JHMV enfeksiyonlu fare omuriliğine transplantasyon yöntemini. Bu teknik, demiyelinizasyon hastalıklarında hücre replasman tedavilerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Hazırlık <ol><li> Xylazine ketamin çözüm (Ketamin kontrollü bir maddedir. Ayrıntılı kayıtları tutulur ve çözümleri, güvenli, kilitli bir yerde muhafaza edilmelidir) hazırlayın. </li><li> Ekipmanı temizleyin ve sterilize edin. </li><li> Aseptik maddesi ile silme ve ardından steril kağıt havlu ile kapsayan cerrahi alanında hazırlayın ve mikromanipülatör kurmak. </li></ol> 2. Hücre nakli için hazırlık <ol><li> Fare başına düşen sadece 250,000 hücreleri nakledilen olmasına rağmen hücreler, 100.000 hücre / É l bir konsantrasyon yeniden bekletildi ve olmalıdır, hücrelerin aşırı şırınga yükleme amacıyla hücrelerini aldıktan fare başına en az 300.000 hücre hazırlamak için gereklidir. </li><li> 50 ml konik flakon HBSS içinde 3 kez nakledilen hücrelerin yıkayın. Final spin önce hücreleri saymak. </li><li> Sonra aşağı final spin, süzün HBSS ve damlacıkları pelet ulaşmasını önlemek için konum aşağı ters flakon terk. </li><li> UV-ışınlanmış, steril Kimwipe Kuru iç duvarları. Pelet kurumasına izin vermeyin. </li><li> Yavaş yavaş, tüp dik Holding ve çok ince HBSS yarısı son istenen birimde hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir pipet süspansiyon çoğunluğu pipetleme ve ardından tüm süspansiyon pipet ucu kadar pipetter çevir ayarlayarak toplam hacmi ölçün. Bu ne kadar daha HBSS istenen konsantrasyon için gerekli size söyleyecektir. </li><li> HBSS ekleyerek istenilen miktarda hacim kazandırın. </li><li> Buz üzerinde geri yerleştirin. 2 saat daha uzun buz gerekiyorsa hücre canlılığı kontrol edin. </li></ol> 3. Cerrahi ve transplantasyon için farelerin hazırlanması <ol><li> Intraperitoneal ketamin (100mg/kg) ve ksilizin ~ 100 ul dozda (10mg/kg) veya eşdeğer bir anestezik enjeksiyon ile fare anestezisi. Cerrahi hazırlık dikilmesi için tüm işlem 30-40 dakika sürer. </li><li> (Opsiyonel: tanımlanmasını sağlamak için her fare kuyruk numaralı, renkli bant uygulamak) </li><li> Boyun alt sırt fare dorsal bölgede Tıraş ve elektrik kesme makineleri ile ikili orta hatta 2 cm uzanan. Saç (bölge üzerinde birkaç kez gitmek için gerekli olabilir) mümkün olduğunca yakın kesilmelidir. </li><li> Kalan saç kaldırmak için bir gazlı bez ile tüy dökücü krem ​​(Nair) ince bir tabaka uygulayın uçlu bir aplikatör. </li><li> 1-2 dakika sonra, kapalı Nair, sabunlu su ile hafifçe ıslatılmış gazlı bez ile silin. Hazırlanan alan sonraki cerrahi işlem sırasında yara alabilir, herhangi bir saç sokak parçaları olmadan çıplak deri temiz olmalıdır. Hazırlanan alan iyodür solüsyonu ile sterilize edin. </li></ol> 4. Laminektomi <ol><li> Prosedürü boyunca eldiven Sıkça değiştirebilir ve / veya sterilize edin. Kafası (sağ elle) sol işaret fare dorsal tarafına yerleştirin. Kısırlık sağlamak ve sadece traş alana maruz kaldığı hayvan Örtüsü. Laminecomy sitesi T12 hakkında torasik vertebra T8 kapsayan üzerinde dikey bir kesi (1.3cm) olun. </li><li> Sol elinde düzenlenen Graefe forseps ile sıkıca omuriliğe T9 (Şekil 1A), güvenli ve omurga eğriliğinin abartmak için fareyi yukarı kaldırın. </li><li> T10 ve T11 arasında kavşak, iki dikenli çıkıntılar arasındaki boşluğu puan neşter kullanın. Ayrıca kemik açığa çıkarmak için (Şekil 1B, C) ​​dikkatle uzakta kas tabakası hurdaya kavşak maruz kalmaktadır. </li><li> Lamina ve pedikül küçük snips etrafında açık kas daha makas kullanın. Bu omurlar arasındaki küçük bir alan açılacaktır. Yavaş yavaş ve ince makas bu boşluğu içine bir bıçak takın ve pedikül snip. Makas eğriliği her zaman kabloyu uzak, yatay konumlandırılmış emin olun. Diğer tarafta tekrarlayın. (Bkz. Şekil 1D, E) </li><li> Kabloyu maruz lamina kaldırın ve dikkatli bir şekilde kapalı snip. Arkasında herhangi bir ücretsiz veya sivri kemik parçaları bırakmamaya emin olun. (Bkz. Şekil 1F) </li><li> Enjeksiyon için, önce herhangi bir kan steril pamuklu çubukla temizleyin. </li></ol> 5. Hücre enjeksiyonu <ol><li> Hamilton şırınga iğne iğne somunu takın ve onlara temiz su, sonra% 70 etanol ile birkaç kez ateş basması, ve nihayet HBSS. Su,% 70 etanol veya HBSS her doldurduktan sonra piston yerleştirin. </li><li> Hamilton şırınga pistonu çıkarmadan ve iğne somunu gevşeterek ve iğne, backpressure önlemek için şırınga uzak çekerek hücre yükleme için hazırlayın. Iğne ve somun dikkatli kullanımı, steril eldiven ile yapılır emin olun. </li><li> Pipet içine hücre 15μl Yük ve ucu şırınganın içine hücreleri yüklemek için şırınga arka ucunu sıkıca basın. </li><li> 5mm hakkında pistonu takın ve ardından iğne somununu sıkın. </li><li> Piston un sıkıptil bazı hücre süspansiyonu iğne çıkmadan görülür. </li><li> Şırınga içinde kabarcıklar vardır ve yerçekimi ile bir degrade hücreleri önlemek için yatay pozisyonda şırınga uzandı emin olun. </li><li> T8 ve T9 (Şekil 2B, C) ​​dikenler bağlayan spinalis dorsi laminectomized fare basılı tut. </li><li> Kelepçe, farenin ön pençeleri havada ve arka pençeleri Şekil 2A ve 2B olarak hafifçe böylece steril kağıt havlu bir platform dokunarak sol (düşey) mikromanipülatör kol hemostat . </li><li> Takın, sağ mikromanipülatör kol (70 ° açıyla) şırınga ve şırınga sıkma önce mümkün olan en düşük pozisyona kaydırın. </li><li> Kağıt havlu karşı kuyruk iğneleyerek ve yavaş yavaş şırınga (Şekil 2B) alt fare sabitleyin. </li><li> Kabloyu doğru iğne Alt ve dorsal orta hat (Şekil 2C) ile ters yarımkürede içine iğne 1mm eklemek . Iğne ucu merkezi kanalına yakın gri cevherde olmalıdır. </li><li> 2.5μl hücrelerin yavaş yavaş enjekte. 1μl / 5 saniye hızında enjekte edilir. Hücreler enjekte ettikten sonra, iğne kablosunun her 10 saniye kadar bir seferde 10 saniye bekleyin ve iğne bir dönüş onda geri çekin. Hücre süspansiyonu mümkün efflux dikkat edin. </li><li> Şırıngaya hızla geri çekin ve mikromanipülatör kolundan ayırmak. Şırınga yatay aşağı yatırın. </li><li> Fare ve dikiş tabloya transfer bırakın. </li><li> Şırınga boşaltılır kadar her fare için 5,7-5,14 adımları tekrarlayın. Araçları (sterilizatör) ve hayvanlar arasındaki iğne (etanol ile silerek) sterilize edin. Hücreler atılır ve topaklanma görülebilir yeniden. </li><li> Yükler arasında adım 5.1 olarak şırınga temizleyin. </li></ol> 6. Dikişler ve post-op bakım <ol><li> Kesi dikin. Sütür iğne kesi her iki tarafta yüzeysel fasya içine eklenir. Konu böylece kaldırılır lamina yerinde maruz omurilik kapsayan, (Şekil 3A) birlikte yüzeysel fasya çekerek üzerinden sinirli. , Deri ya da arka iskelet kası bağlı deri kas sütür etmeyin. Iğne tutucu, üç knot oluşan ve iplik düğüm mümkün olduğunca yakın olarak kesilmiş yaklaşık 1 / 2 ". Bırakarak aracılığıyla tüm konu çekin. </li><li> 02:58 zımba (kesi büyüklüğüne bağlı olarak) deri (Şekil 3B) uygulayarak kesi kapatın. Dikkatlice altta yatan kas zımbalama önlemek için fare uzak cilt çekin. </li><li> 26G3 / 8 iğne kullanarak alt kutanöz kesi uzak alt sırt, 0.5 ml Laktatlı Ringers enjekte edilir. </li><li> Kendi kafesine geri koyun fare. Anestezi altında cerrahi sitesi ve kafesli yataklar arasındaki temas kaçınarak, fare, kafese yana yatık olmalıdır süre rahat nefes sağlamak. Kafesler ısıtma pedleri konulmalıdır. </li><li> Anestezi, kanama azalır sağlamak için kapalı giyer sonra Fare izlenir, dikiş kapalı kalır ve bu farelerin ameliyat öncesi hareketlilik dönmek. </li><li> Analjezik buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) aşağıdaki cerrahi ile farelerin bir kez davranın. </li><li> Bozulmuş farelerin yiyecek ve su yeterli erişimi olduğundan emin olun: 3.5 inç emzikli ve elle beslenen su ve / veya yüksek kalorili besin takviyesi (Nutri-Cal, Tomlyn) yürüyemez fareler uzun su şişeleri ile donatılmıştır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Istenen sonuçları enjeksiyon sırasında hücre süspansiyonu efflux eksikliği ve prosedürü takip omurilik sağlam görünüşü tanımlanabilir olacaktır. Bu amaçla, laminektomi sırasında ve enjeksiyon sırasında farenin omurga üzerinde parlak ve direkt aydınlatma için hayati önem taşımaktadır. Optimal aydınlatma, fiber optik aydınlatma (Şekil 2A) tarafından kolaylaştırılır . <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 - Laminektomi (A) Bir omur T9 sağlam puan mikro makas girişini kolaylaştırmak için T10 ve T11 arasında bistüri ile omurga (B, C), Graefe forseps ile tutulur. (D), T10 ve T11 (oklar ve içerlek, E) arasında dikkatlice uzayda mikro makas slayt ve dorsal lamina serbest bırakmak için her iki tarafta pediküller (tire, E) kesmek. (F) rostrally lamina yukarı kaldırın ve kesti. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. NSC'lerde enjeksiyon (A), 70 açıyla sağ kol, sol kol ve Hamilton şırınga bağlı fare tutarak hemostat mikromanipülatör genel kurulum. (B) hemostat, T8 ve T9 dikenler bağlayan spinalis dorsi tutun. (C) iğne, t ile indirilir.o orta hat ve merkez kanalın proksimalinde ters yarımkürede gri madde, içine. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Dikişler ve yaranın kapanması (A) Dikişler kesi her iki tarafta yüzeysel fasya uygulanır. (B) gerektiği gibi 2-3 zımba ile (3 gereken bir yara üzerinde gösterilen bir elyaf) kesi kapatılır.

<ol><li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+multiple+sclerosis%3A+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li>
<li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+%28MHV-4%29%3A+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li>
<li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li>
<li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li>
<li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlakemore%2C+WF+%22Transplantation+of+glial+cells+into+areas+of+demyelination+in+the+adult+rat+spinal+cord%22">Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord</a>. , Oxford UP. Oxford. (1992).</li>
<li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li>
<li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li>
<li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li>
</ol>

Iyi uygulanmış bir nakli hücreleri dikkatli laminektomi ve enjeksiyon öncelikle menteşe. Bir laminektomi sırasında önlemek için birincil hatadır omurilik zarar. Bu işlem sırasında veya prosedürü takip geride bırakmış keskin kemik parçaları nedeniyle hasar oluşabilir. Bunları önlemek için, kavisli mikro makas noktaları, her zaman kabloyu uzak bakacak şekilde sağlamak ve tüm kemik parçaları temizlenmiş olduğundan emin olmak için dikkatlice laminectomized omurga incelemek ve kalan vertebral yapısı açıkça çıkıntılı ya da pürüzlü sahip değildir kenarları bu. Daha önce de belirtildiği gibi ışık enjeksiyon sırasında, parlak ve doğrudan maruz omurilik üzerine parlayan ise, efflux tespiti mümkün olacaktır. Efflux 30 insülin iğnesi (karşı 33 gauge) ve enjeksiyon çok hızlı bir şekilde yapılır gerçekleşmesi en muhtemel. Bu protokol bize iyi sonuçlar vermiş olsa da, diğerleri geri çekilmeden iğne aşağıdaki enjeksiyon 8,9 önce (5 dakika) bekleme süresi uzun bildirdin. Ayrıca, daha küçük ölçü iğneler tercih edilir, ancak 33 insülin iğnesi geçerken bazı hücreler çok kolay parçalanmış olduğunu gözlemledim. Verimliliği maksimize etmek için, dört farklı istasyonları (fare hazırlık, laminektomi, enjeksiyon ve dikişlerle) personel nakli ekibi arzu edilir. Ayrıca, her bir işlem için zamanlama hücreleri buz üzerinde bekliyor süresini en aza indirmek için optimize edilmelidir. Örneğin, dört (şırınga her yük doz sayısı) gruplar halinde farelere nakli, kişi hücreler enjekte edildikten sonra üçüncü fare laminectomized şırınga yükleme başlar ve farelerin hazırlayan kişi aşağıdaki uyutmak önceki grubun ikinci fare sonra grup laminectomized olmuştur. Bu şekilde, her bir fare yaklaşık 30-40 dakika alacak olsa bile biz yaklaşık 3 saat 40 farelere hücreleri (veya kontrol medya) nakli. Hücre replasman tedavileri bazı merkezi sinir sistemi bozukluklarının tedavisi için 10 klinik çalışmalarda şu anda. MGK transplantasyonu ve viral kaynaklı demiyelinizasyon MS önemli bir model kullanımını kolaylaştırır farelerin omurilik içine NSC&#39;lerde engraftman için protokol vivo modeller için herhangi bir yerini tutamaz ve aynı zamanda diğer modellere kolayca adapte edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix İlaç </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine hidroklorür </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Kilise ve Dwight A.Ş. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ul Hamilton Şırınga w / Çıkarılabilir iğne </td><td> Hamilton Şirket </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton İğneler, 30G veya 33 G, ½ inç, 30 ° eğim </td><td> Hamilton Şirket </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Test kullanmak için en iyi göstergesi belirlemek için iğne geçişi aşağıdaki hücrelerinin canlılığı </td></tr><tr><td> Mikro Makas </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Küçük Graefe Forseps </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 1772 Evrensel Tutucu </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 1773 Elektrod Tutucu </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 902 küçük hayvan stereotaksik </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 960 sol elektrot taşıyıcı </td><td></td></tr><tr><td> Dikişler </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Laktatlı Ringers </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Güzel Bilim </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturiler, boyutları 10,11 </td><td> Balıkçı </td><td> 268.878, 268.879 </td><td></td></tr><tr><td> Dikişler </td><td> Ethicon </td><td> 1676G </td><td> boyutu 5-0, 3 / 8 &quot;daire, 19mm iğne, 45cm örgülü iplik </td></tr><tr><td> Refleks 7 yara klip aplikatör </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm Refleks yara klipleri </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar iğne tutucu </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

spinal kordonlar nörotropik mouse hepatit virüs ile etkilenmiş fare fare nöral kök hücre transplantasyon cerrahi

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Nörotropik JHM suşu (MHV) fare hepatit virüsü ile enfekte Fare demiyelinizan hastalık Multipl Skleroz (MS) olan hastalarda benzer patolojik ve klinik sonuçları geliştirmek. Biz hem remiyelinizasyon ve klinik sonuç önemli bir gelişme hasta farelerin sonuçları omurilik içine NSC&#39;lerde bu nakli göstermiştir. Hücre replasman tedavileri kronik nörolojik hastalıkların tedavisi için artık bir gerçeklik ve in vivo modellerde engrafted hücreleri ve ev sahibi doku mikro-çevre arasındaki etkileşimleri anlamak hayati önem taşımaktadır . Bu sunum adapte JHMV enfekte farelerde omuriliğe hücre nakli için bir yöntem sağlar. Kısacası, biz)) ii, nakli önce) post-operatif bakım farelerde pre-operatif bakım, iii) laminektomi ile omurilik maruz kalma, iv) NSC&#39;lerde stereotaktik enjeksiyon, ve iv NSC&#39;lerde hazırlanması i için bir prosedür .

Kurulan demiyelinizasyon ile farelerin omurilik içine fare sinir kök hücrelerinin (NSC&#39;lerde) nakli ayrıntılı. NSC&#39;lerde hazırlanması, torasik vertebra 9 (T9) ve NSC&#39;lerde nakli laminektomi farelerde pre-ve post-operatif bakım birlikte özetlenmiştir.

Spinal Kordonlar nörotropik Mouse Hepatit Virüs ile Etkilenmiş Fare Fare Nöral Kök Hücre Transplantasyon Cerrahi

Mouse hepatitis virüsünün (MHV) nörotropik JHM suşu ile enfekte edilen fareler, ... hastalarıyla benzer patolojik ve klinik sonuçlar geliştirirler.

Bu prosedürün genel amacı, JHMV enfekte farelerin omuriliğine nöral kök hücreler transplantasyonu yoluyla, demyelinizasyon gelişmiş hayvanlarda remiyelinizasyonu ve klinik iyileşmeyi teşvik etmektir. Bu işlem öncelikle hayvanın hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, torakal vertebralar seviyesinde laminektomi yapmaktır.Ardından, açığa çıkarılan spinal korda 10 hücre enjekte edilir. Başarılı bir enjeksiyonun ardından yara kapatılır. Nihayetinde, spinal korda fare nöral kök hücrelerinin varlığı saptanır.Parankim; floresan mikroskopi, JHMB'nin omuriliğine nöral kök hücre transplantasyonu gibi yöntemlerle görselleştirilebilir. Enfekte fareler, hücrelerin nasıl göç ettiği, çoğaldığı ve farklılaştığının yanı sıra hücrelerin merkezi sinir sistemini nasıl etkilediği gibi, demiyelinizan hastalıkların tedavisine yönelik hücre replasman terapileri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, terapötik faydalarını artırmak için hücreleri veya transplant edildikleri omurilik ortamını modifiye edip edemeyeceğimiz konusuna da ışık tutabilirler.Bu yöntem, demiyelinizasyonun viral bir modelinde hücre değiştirme tedavisine dair bilgi sağlayabilse de, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) ve omurilik yaralanması gibi diğer demiyelinizasyon ve yaralanma modellerine de uygulanabilir. Hücreleri enjeksiyona hazırlamadan önce, gerekli tüm solüsyonları hazırlayın. Ardından, tüm ekipmanları temizleyin ve sterilize edin.Cerrahi alanı hazırlayın ve transplantasyon için hücreleri tripsinizasyonla hazırlamak üzere mikro manipülatörü kurun, ardından hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpte yeniden süspande edin. Transplant edilecek hücreleri HBSS içerisinde üç kez yıkayın. Son santrifüjden önce hücreleri sayın.Son santrifüjden sonra HBSS'yi çöktürerek uzaklaştırın ve damlacıkların pelete ulaşmasını önlemek için tüpü ters konumda bırakın. İç duvarları UV ışınına maruz bırakılmış steril bir Kim wipe ile kurulayın. Peletin kurumasına izin vermeyin.Tüpü dik tutarak yavaşça ve çok hassas bir şekilde hareket ettirin. Hücreleri, istenen nihai hacmin yarısı kadar HBSS içerisinde yeniden süspanse edin. Nihayetinde hücreler, mikrolitre başına 100,000 hücre konsantrasyonunda olmalıdır.Süspansiyonu bir pipet ucuna çekerek ve ardından tüm süspansiyon pipet ucunda kalana kadar pipetleyicinin kadranını ayarlayarak toplam hacmi ölçün. Bu işlem, istenen konsantrasyon için ne kadar daha HBSS gerektiğini belirlemenizi sağlayacaktır. Hücreleri istenen hacme tamamlayın.HBSS ekleyerek hücreleri bir efp tüpüne aktarabilirsiniz. Hücreleri tekrar buz üzerine yerleştirin.Hücrelerin iki saatten daha uzun süre buz üzerinde kalması gerekiyorsa, hücre canlılığını kontrol edin. Cerrahi prosedüre başlamak için, ayak parmak sıkıştırma refleksi aracılığıyla anestezinin uygun düzeyde olduğunu doğrulayın. Farelerin sırt bölgesini, belin alt kısmından boyuna kadar tıraş etmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.Alan tıraşlandıktan sonra, kalan tüyleri temizlemek için ince bir tabaka tüy dökücü krem uygulayın. Bir ila iki dakika sonra, alanı önce kuru gazlı bezle, ardından sabunlu suya hafifçe batırılmış gazlı bezle silerek temizleyin. Cerrahi alan artık tüylerden arınmış olmalıdır.Son olarak, hazırlanan alanı Betadine solüsyonu ile sterilize edin ve gözlere pomad uygulayın. Kurumayı önlemek için fareyi sırtı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Torakal vertebralar civarından başlayan laminektomi bölgesinin üzerinden bir insizyon yapın.T 8 ile T 11 arası. Omurganın kavisini belirginleştirin ve T 10'u bulun. Bu, düz bir çıkıntıya sahip olan ilk omurdur ve genellikle omurga kavisinin tepe noktasının iki omur rostralinde yer alır.Gri pensle omurgayı sıkıca sabitleyin. T9 seviyesinde, T10 ve T11'in iki dikenli çıkıntısı arasındaki boşluğu bir bistüri ile çizin. Ardından, makasın kavisli kısmının korddan uzağa baktığından emin olarak, alttaki kemiği açığa çıkarmak için kas tabakasını sıyırın.Makasın bir ucunu yavaşça T 10 ile T 11 arasına yerleştirin. Makas ucunu omurilik ile T 10 pedikülü arasına kaydırın ve pedikülü kesin. Aynı işlemi diğer taraf için tekrarlayın. Alttaki omuriliği açığa çıkarmak için laminayı kaldırın ve dikkatlice kesin.Geride hiçbir serbest veya pürüzlü kemik parçası kalmadığından emin olun. Tüm kemik parçaları temizlendikten sonra, herhangi bir kanı steril pamuklu çubuklarla silin. İlk olarak, iğneyi iğne somunu ile takarak Hamilton şırıngasını hazırlayın.Pistonu yerleştirin ve birkaç kez suyla durulayın. Temizlendikten sonra %70 etanol ve HBSS ile yıkayın. Pistonu çıkarın ve iğne somununu gevşetin.Geri basıncı önlemek için iğneyi şırıngadan uzaklaştırın. Hücreleri yüklerken, pipet ucunu şırınganın arkasına sıkıca bastırarak şırıngaya 15 µL hücre yükleyin. Pistonu yaklaşık beş milimetre içeri itin ve ardından iğne somununu sıkın.Hücre süspansiyonunun bir kısmının iğneden çıktığı görülene kadar pistonu bastırın. Şırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun ve hücrelerin yer çekimi nedeniyle gradyan oluşturmasını önlemek için şırıngayı yatay olarak yerleştirin. Hayvana geri dönerek, S spinous doci kasını kavramak için hemostatlar kullanın.T sekiz ve T dokuz omurlarının birleştirilmesi. Farelerin ön patileri havada, arka patileri ise steril kağıt havlu platformuna hafifçe değecek şekilde hemostatı sol mikro manipülatör koluna sabitleyin.Şırıngayı sağ mikro manipülatör koluna 70 derecelik bir açıyla takın ve sabitlemeden önce şırıngayı mümkün olan en alt konuma kaydırın. Fareyi, kuyruğunu kağıt havlulara sabitleyerek stabilize edin. İğneyi yavaşça korda doğru indirin.Ucu, dorsal orta hat üzerinden karşı hemisferin bir milimetre içine yerleştirin. İğnenin ucu gri madde içinde veya merkezi kanala yakın, ancak kanalın içinde olmamalıdır. 2,5 microliter hücreyi, beş saniyede bir microliter hızla yavaşça enjekte edin.Hücreleri enjekte ettikten sonra 10 saniye bekleyin ve iğneyi geri çekin. On birimlik bir tur döndürün. İğne kordondan tamamen çıkana kadar her 10 saniyede bir bu hızda geri çekmeye devam edin.Hücrelerin çok hızlı enjekte edilmesi veya iğnenin çok hızlı çekilmesi, hücre süspansiyonunun geri akmasına neden olabilir. Böyle bir durum gerçekleşirse, fareyi çalışmadan çıkarın. Kordondan ayrıldıktan sonra, iğneyi hızla geri çekin ve şırıngayı mikro manipülatör kolundan ayırın.Fareyi tekrar yatay konuma getirin. Fareyi serbest bırakın ve bir sütur masasına aktarın. Şırınga boşalana kadar bu prosedürü her bir fare için tekrarlayın.Kümelenme görülürse hücreleri atın ve her yükleme arasında şırıngayı yıkayıp temizleyerek yeniden doldurun. Enjeksiyondan sonra hayvan, dikiş atılması için ayrı bir konuma aktarılır. Sütür iğnesini insizyonun her iki yanındaki yüzeysel fasyadan geçirin.Fasyayı bir araya getirmek ve çıkarılan lamina bölgesindeki açıkta kalan omuriliği örtmek için süturu çekin. Üç düğüm atmak için forseps ile bir iğne tutucu kullanın ve ipin mümkün olduğunca fazlasını kesin. Fare derisi geri çekilirken genellikle tek bir sütur yeterlidir.Alttaki kasın zımbalanmasını önlemek için insizyonu iki ila üç zımba ile kapatın. Yara kapatıldıktan sonra, belin alt kısmına, ancak insizyon bölgesinden uzağa, deri altına 0.5 milliliters laktatlı ringer solüsyonu enjekte edin. Fareyi kafesine yan şekilde yerleştirin ve cerrahi bölgenin kafes altlığa temas etmediğinden emin olun.Hayvanları tamamen iyileşene kadar izleyin. Bu görüntü, spinal kordun koronal bir kesitinde başarıyla nakledilmiş GFP etiketli fare nöral kök hücrelerini göstermektedir. Nakil sonrası 21. gün.Bu videoyu izledikten sonra, nöral kök hücrelerin JHMV enfekte farelerin omuriliğine nasıl nakledileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, yaklaşık üç saat içinde 40 fareye uygulama yapmak mümkündür.

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Sinir habercisi nakli, korunması ve / veya spinal kord yaralanması (SCI) ve motor nöron bozukluğu, amiyotrofik lateraller skleroz (ALS) kaybettim / işlevsiz servikal frenik motor nöronların yerini gelecek vaat eden bir strateji. Biz, ALS ve SKY kemirgen modellerinde servikal omurilik ventral boynuz hücre teslimat için bir protokol sağlar.

Amyotrophic Lateral Sclerosis ve Travmatik Spinal Kord Yaralanması Servikal Ventral Horn Hedefleme intraspinal Hücre Transplantasyonu

Kaynak: Weber, R. Z., et al. Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İntraserebral Transplantasyon ve İn Vivo Biyolüminesans İzlemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, genetiği değiştirilmiş insan nöral progenitör hücrelerinin (NPC'ler) fare beynine stereotaksik transplantasyonunu göstermektedir. Araştırmacılar, lusiferaz ve floresan proteinleri eksprese eden NPC'leri enjekte ederek, in vivo biyolüminesans görüntüleme ve ölüm sonrası floresan mikroskobunun hücre sağkalımını, göçünü ve...

Fare beynindeki insan nöral progenitör hücrelerinin nakli

Kaynak: Furmanski, O., et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöral Hücrelerin Terapötik Nakli ile Fare Beyin Hasarının Kontrollü Kortikal Etki Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu videoda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi sinir hücreleri, travmatik beyin hasarının bir fare modelinde derin korteksin gri madde-beyaz madde sınırına stereotaksik olarak enjekte edilmektedir. Nakledilen hücreler dokuya entegre olur ve yaralı beyinde fonksiyonel iyileşmeyi ve devre onarımını...

Nöral Hücre Süspansiyonunun Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fareye Stereotaksik Nakli

Bu video, onkolitik virüs yüklü terapötik nöral kök hücrelerin beyin tümörü taşıyan bir fare modeline intranazal iletimini göstermektedir. Kök hücrelerin non-invaziv intranazal uygulaması, kan beyin bariyerini atlayarak, terapötik uygulamalar için beyindeki tümör bölgesine verilmelerini kolaylaştırır.

Murin Modelinde Terapötik Nöral Kök Hücrelerin (NSC'ler) İntranazal Dağıtımı: Onkolitik Virüs Yüklü NSC'lerin Beyin Tümörü Taşıyan Fare Modeline Tümör Hedefli Verilmesi İçin Bir Prosedür

Kaynak: Parajuli, B., et.al. İmmünkompetan Farelerin Beyninde İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia'nın Non-İnvaziv Transnazal Yol ile Transplantasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikroglia (iPSMG) hücrelerinin bir fare beynine trans-nazal transplantasyonunu göstermektedir. Hyaluronidaz, geçirgenliği artırmak için mikroglial tükenmiş bir farenin burun deliklerine uygulanır. iPSMG süspansiyonu intranazal olarak uygulanır ve...

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı İnsan Mikroglial Hücrelerinin Fare Beynine Transnazal Nakli

Burada, olgunlaşmamış ve genişletilebilir insan hepatik kök hücrelerinin transplantasyonunu takiben Alb-toksin reseptörü aracılı hücre nakavt (TRECK)/SCID farelerinde üretilen yeni bir insanlaştırılmış fare karaciğeri modeli sunuyoruz.

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

Kök hücreler tümör tropizminden ötürü beyin tümörlerini tedavi etmek için terapötik taşıyıcıları umut vericidir. Non-invaziv intranazal kök hücre iletimi kan beyin bariyerini atlar ve klinik çeviri için güçlü bir potansiyel gösterir. Bu makale, glioma fare modelinde intranazal kök hücre sunumunun temel ilkelerini özetlemektedir.

Bir Fare Modelinde Tedavi Edici Kök Hücrelerin Glioblastomaya İntranazal Dağıtımı

Kısmi hepatectomy (PHx) ve hücre transplantasyonu dalak ile NOD gerçekleştirmek için bir protokol anlatmıştık. SCID (BAŞINI SALLAMAK. CB17-Prkdcscid/J) fareler. Bu protokol için ortaya çıkarmak ve hücre intrasplenic nakli için başka bir kesi ardından karaciğer sol lob çıkarabileceğim için bir kesi yapılır.

Hepatositlerin intrasplenic nakli düğümde kısmi Hepatectomy sonra. SCID fareler

Fare beyninde lusiferaz-yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden ikili muhabir bir vektör ile transdüke edilen insan nöral progenitör hücrelerinin intraparankimal transplantasyonunu tanımladık. Transplantasyondan sonra, lusiferaz sinyali, floresan mikroskobu kullanılarak beyin bölümlerinde tanımlanan in vivo biyolüminesans ve GFP eksprese eden aşılanmış hücreler kullanılarak tekrar tekrar ölçülür.

İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Burada sunulan protokol, immünkompetan farelerde transnazal bir yolla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikrogliasının (iPSMG) beyne transplantasyonuna izin verir. Hücrelerin hazırlanması ve transnazal transplantasyonu ve iPSMG'nin idamesi için sitokin karışımının uygulanması yöntemi gösterilmiştir.

İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu

Mevcut protokol, tümör hücrelerinin intervertebral boşluğa enjekte edilmesiyle tekrarlanabilir bir murin spinal kord gliomu modelinin geliştirilmesini tanımlamakta ve araştırma ve terapötik geliştirme için daha etkili ve daha az invaziv bir yaklaşım sunmaktadır.

Tümör Hücrelerinin Farelerin Omuriliğine Cerrahi Nakli

Keşfedin, fare nöral kök hücrelerinin JHMV enfeksiyonlu fare omuriliğine transplantasyon yöntemini. Bu teknik, demiyelinizasyon hastalıklarında hücre replasman tedavilerini incelemek için kullanılır.

Spinal Kordonlar nörotropik Mouse Hepatit Virüs ile Etkilenmiş Fare Fare Nöral Kök Hücre Transplantasyon Cerrahi

Daha fazla video keşfet