Name: Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Öğrenin, onkolitik vaccinia virüsü ile taze cerrahi dokuların ek vivo enfeksiyonunu ve viral çoğalmayı GFP/biyolüminesans görüntüleme ile nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, kanser tedavisi için hasta seçimine rehberlik eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Şekil 2&#39;de sunulan veriler insan cerrahi örneklerin sağlamak için Dr. Hesham Abdelbary teşekkür etmek istiyorum.

1. Doku işleme <ol><li> En iyi sonuç için, bu protokol taze izole doku% 10 işlenmeden önce cerrahisi sonrası FBS,% 1 Pennicilin / Streptomisin çözüm ve hemen% 0.1 Amphothericin B çözeltisi içeren DMEM medya yatırılan kullanarak yapılmalıdır. Bu mümkün değilse, doku işlenmeden önce 4 derece Bu ortamda bir gecede terk edilebilir. </li><li> Önce numune işleme, en az 5 dakika boyunca% 70 etanol çözüm tevdi ederek metal forseps ve tek kanatlı sterilize edin. Ayrıca,% 10 DMEM medya içeren 2 ml FBS,% 1 Pennicilin / Streptomisin çözüm ve% 0.1 Amphothericin B. ile 24-plaka hazırlamak </li><li> Doku örneği steril forseps kullanarak bir laminer akış hücre kültürü kaputu toplayın ve steril yan tarafında kapak uydurarak, boş bir 15 cm petri doku yatırmak. </li><li> Hücre kültürü kaputu, 2 mm biyopsi yumruk, Şekil 1 gibi doku içindeki bölgelerde çeşitli farklı çekirdek elde etmek için kullanın. Yatay eksende kolaylıkla kesilebilir, böylece her bir çekirdek arasında yeterince boşluk bırakarak, forseps yardımı ile 15 cm Petri kapağın çekirdek Depozito. </li><li> Şekil 1'de olduğu gibi steril bir jilet ile 4 hatta dörtte Split her bir çekirdek. </li><li> Pipetlemeyin ucu kullanarak, zaten DMEM 10% FBS,% 1 Pennicilin / Streptomisin çözüm ve% 0.1 Amphothericin B çözeltisi içeren 1.5 ml içeren, Şekil 1'de olduğu gibi A4 A1 farklı bir sıra belirli bir çekirdek, her çekirdek çeyrek koymak . Her çekirdek için tekrarlayın. Bu önyargı, belirli bir kuyu / durumda en aza indirirken, tümör temsili örnekleme izin vermelidir. Daha iyi temsil için, çekirdek sayısını artırmak. </li></ol> 2. Doku canlılığının değerlendirilmesi <ol><li> Şekil 1'de gösterilen ve 1 saat süreyle% 5 CO 2 ile 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe takiben doku işleme, iyi # A1 ve # A2 25μl Alamar mavi. </li><li> Takiben kuluçka Alamar mavi, her A1 ve A2 de 3 kez 100 ul kaldırmak ve 6 farklı bir 96-plaka kuyu transfer. Floresan plaka okuyucu (530 uyarma, 590 emisyon) kullanarak sinyal okuyun ve kayıtlarınız için verileri tutmak. </li><li> Alamar mavi sinyali okunduktan sonra, DMEM,% 10 FBS + PS + AmphoB içerdiğini de A1 C1, bir pipetlemeyin ucunu kullanarak tüm doku parçalarını aktarmak. Iyi bir ortam A1 aşırı miktarda transfer etmek için dikkatli olun. </li><li> 10 6 GFP-ifade ve medya 25 ul vaccinia virüs seyreltilmiş lusiferaz ifade PFU sırasıyla kuyuları A3 ve A4 bozar. Eh, A2, hiç de dahil olmak üzere herhangi bir transgen ifade eden bir virüs ile enfekte olabilir. </li><li> 72 saat sonra, 25 ul Alamar mavi kuyuları C1 ve D1 ve 2.2 adımı tekrarlayın </li></ol> 3. Floresans mikroskobu ile GFP transgen ifade Görselleştirme <ol><li> Hücre kültürü, iyi floresan fotoğraf çekmek için doku parçaları kapsayan tüm medya çıkarın. </li><li> Bir floresan yetenekli diseksiyon mikroskop kullanarak, öncelikle uygun bir çözünürlükte bir faz kontrast görüntü çekmek </li><li> Floresan moduna geçin ve bu durumda, GFP, faiz transgen görselleştirmek için uygun filtre kullanılarak bir resim çekmek. </li><li> Eşiğe bir resim çekmek için faiz transgen (TTT) o kadar olası bir başka dalga boyu için bir floresan filtre kullanın </li></ol> 4. Lusiferaz ifade Görselleştirme Vivo görüntüleme Sistemi (IVIS) yöntemiyle <ol><li> Başlamadan önce IVIS başlatıldı olduğundan emin olun. </li><li> Kuyuları A4 ve B4, luciferase substrat 10 mg / ml, iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe 5 ul ekleyin. </li><li> IVIS maruz kalma süresi 5 saniye ayarlayın ve kuyuların bir resim çekmek. Görüntü doymuş ise, düşük pozlama süresi ile tekrarlayın. Herhangi bir sinyal varsa, pozlama süresi artar. </li><li> IVIS görüntüleme yazılımı kullanarak, iyi B4 sinyal kullanılarak arka plan kaldırmak ve lüminesans sinyali ölçmek için ilgi bölgenizi seçin. </li></ol> 5. Plak yöntemi ile viral titreleri Değerlendirilmesi <ol><li> Viral titreleri niceleme önce, dokular ilk viral parçacıkların serbest homojenize olması gerekir. -80 Saklanan enfekte doku örnekleri, birkaç ay sonra yapılabilir </li><li> Analitik bir ölçek kullanılarak homojenize olması gerekir örnek tartılır. Bu durumda, biz iyi A2 toplanan örnek kullanabilirsiniz. </li><li> Doku 5 ml polistren yuvarlak alt şahin tüp yerleştirin ve 1 ml PBS ekleyin. Doku homojenizatörü kullanarak doku homojenize. Gerekirse, daha sonraki bir zamanda viral titreleri değerlendirmesi için -80 Homojenat saklayın. </li><li> Titresi vaccinia virüs, ilk 6 plaka plaka 1 milyon U2OS hücreleri ve 37 derecede gece boyunca inkübe% 5 CO 2 nemliified inkübatör confluency ertesi gün yaklaşık% 95 ulaşmıştır. </li><li> Her seyreltme adım arasındaki ipuçları değiştirmek için emin olun, virüs seri dilüsyonları serum ücretsiz medya kullanın. Genelde biz 10 dilüsyonları 1 ve 900 ul içine aktarmak için 100 ul kullanabilirsiniz. Kaç dilüsyonları yapılan beklenen virüs verimi bağlıdır. </li><li> Dilüsyonları ardından, kaplama U20S hücreler daha sonra U2OS hücreleri enfekte seyreltilmiş virüs stokunun 500 ul (her seyreltme için) kapsayan medya çıkarın. 1 saat dakika için% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör sıcaklık 37 derece hücreleri inkübe edin. </li><li> Bu süre zarfında, DMEM% 20 FBS ve 37 derecelik su banyosunda 3% CMC çözüm içeren konsantre 2 X ısınmak. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, enfekte U2OS hücreleri kapsayan medya çıkarın. 2X DMEM birlikte,% 20 FBS ve enfekte U2OS hücrelerinin her iyi karşılamak için bu karışıma 2 ml% 3 CMC 01:01 hacimleri karıştırın. </li><li> Başka bir 48 saat boyunca 37 derece,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör hücreleri koyun . </li><li> 48 saat sonra, her bir kuyunun CMC bindirme üstüne 2 ml metanol-asetik asit fiksatif ekleyin ve bir hücre kültürü kaputu 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Sabit kaplama musluk suyu kullanarak kuyuların kalanı atın ve yıkayın. </li><li> 2ml Coomassie mavi çözüm için de sabit U2OS hücreleri Leke ve bir tabak çalkalayıcı düşük hızda oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Coomassie kuyulardan leke ve musluk suyu kullanarak tabak yıkama çıkarın. Kapak kapalıyken yaklaşık bir saat boyunca kurumasını bekleyin. </li><li> Sonuç viral plaklar Şekil 2C kolayca görüntülenebilmekte. Tabaklar bu aşamada süresiz olarak saklanabilir. </li><li> 10 ila 100 plaklar görülebilir seyreltme aşamada plaklar güvenin. </li><li> Kullanılan seyreltme sayılır plakların sayısını çarpın ve PFU / ml bir titresi vermek için 2 ile çarpın. 25 plaklar iyi bir milyon kat seyreltme sayılır Örneğin, ilk sulandırılmamış örnek titresi 25, 2 ya da 50 milyon PFU / ml ile çarpılır 1 milyon ile çarpılır. Ayrıca PFU / g titreleri rapor örnek için başlangıçta ağırlığını ölçmek bu sayıyı bölmek </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Doğru bir ameliyatla elde normal / tümör doku örneği veya infectable virüs olup olmadığını belirlemek için, bir ilk doku örneği uygulanabilir en emin olmanız gerekir. Şekil 1A, bu canlılığı metabolik bir boya (Alamar mavi) ve, en azından 72h bir süre boyunca hem normal ve tümör dokusu metabolik olarak aktif kalır kullanılarak tespit edilebilir gösterir. Bu dokuların kültürlerinde ex vivo viral replikasyon destek düşündürmektedir. Oncolytic virüsler önemli bir avantajı da, tedavi ya da görüntüleme transgenlerin ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Şekil 2B-E GFP veya Lusiferaz daha bu dokuların, canlı ve aynı zamanda infectable olduğunu destekleyen, ex vivo enfekte dokuların tespit edilebilir olduğunu gösterir. Artan transgen ekspresyonu genellikle viral replikasyon ile ilişkili olmasına rağmen, mutlaka terapötik aktivite için önemli olduğu düşünülmektedir kendini amplifikasyon ve yayılması, yol açar, üretken bir viral yaşam döngüsü için eşit değildir. Bu nedenle, başlangıçta doku zarar vermek için kullanılan daha fazla virüs olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Şekil 2B plak yöntemi ile viral kantifikasyon üzerine daha fazla virüs sonra doku enfeksiyonu hemen sonra toplanan 72 saat enfeksiyon sonrası elde olduğunu gösterir. Genel olarak tümör dokusu cerrahi olarak eksize zaman viral replikasyon sırasında destek olabilir, en az 72 saatlik bir süre için hücre kültüründe canlı kalır ki, bu veriler göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Doku Bakış numune / kesit protokolü Doku örneği birkaç 2 mm çekirdeği daha sonra rastgele kuyuları A1-A4 dağılır dört çeyrek ayrılır kaldırarak işlenir. Renk kodları her kuyuda kullanılan reaktifler göstermektedir. Kuyu içinde gri gölgeli kareler tasvir 6 ayrı çekirdeğe kadar her çeyrekte temsil eder. Iyi A1 doku ilk Alamar mavi okuduktan sonra medya ile yeni bir kuyu (C1) aktarılır. Virüsler ile 72 saat inkübasyon sonunda ikinci bir okuma yapılır. Wells A4 ve B4 72 saat inkübasyon sonrası enfeksiyon sonra luciferase ile desteklenmiş <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Canlılık ve hasta doku örnekleri infectability. A) 2 saat Alamar mavi sinyal ve 72 saat toplama ile ölçülen Doku canlılığı. Y ekseni boş düzeltilmiş Alamar mavi sinyali temsil eder. B) vaccinia virüs titresi2 ve 72 saat sonrası enfeksiyon C Coomassie boyama D U2OS hücreleri üzerinde vaccinia virüs plaklar) Örnek) Lüminesans sinyal hasta VV-lusiferaz enfekte doku elde edilen doku örneklerinde gram başına toplanan IVIS kullanarak görüntülü E) Floresans mikroskobu resimleri VV-GFP ile enfekte hasta doku örneği.

<ol><li>Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+battle+between+oncolytic+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).</li>
<li>Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III%2FIV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li>
<li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reovirus%3A+Rationale+and+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li>
<li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus%2C+JX-594%2C+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer%3A+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li>
<li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+clinical+development+landscape+for+oncolytic+viruses+and+other+cancer+therapeutics%3A+no+shortcuts+on+the+road+to+approval.+Cytokine+Growth+Factor+Rev%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev.</a> 21, 85-89 (2010).</li>
<li>Boeuf, F. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+oncolytic+viruses+augments+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing.</a> Mol Ther. 18, 888-895 (2010).</li>
<li>Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+trouble+for+tumours%3A+exploiting+the+tumour+microenvironment+to+enhance+anticancer+effect+of+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).</li>
<li>Diallo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
<li>Cooke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li>
<li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kuip, H. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li>
</ol>

Bu protokol kritik adımlardan biri taze doku örneği alınmasıdır. Bir örnek, uygun olmayan bir ortam (örn. PBS) ameliyathane Uzun bir bekleyişin ardından hücre kültürü koymak ise, bu doku canlılığı uzlaşma ve infectability önlemek olabilir. Notu, normal doku doğal olarak daha fazla tümör dokularında bu etkilerin daha eğilimli. Bir başka kritik nokta, doku ve tutarlılığı örnek boyutu nasıl kullanıldığını birçok çekirdek. Gibi faktörler, doku hipoksisi ve infectectable yüzey, çekirdek ve çekirdek dörtte boyutuna bağlı olarak dalgalanma beri boyutu tutarsızlıklar hasta numunelerinin arasında değişkenlik yol açacaktır. Bu doku dilimleme makineleri kullanılarak kısmen çözülebilir ederken, burada sunulan yöntemin bir avantajı kolayca uygun olmayan, yumuşak veya viskoz dokular dahil olmak üzere, nispeten kolay olduğunu kirliliğine karşı daha az eğilimli ve doku tiplerinin çeşitli yaygın olarak uygulanabilir. doku dilimleme. Özellikle, çekirdek sayısı, daha iyi doku temsil almak için artırılabilir. Ayrıca, çekirdeklerin paralel yapılacak DNA, RNA ve protein izolasyonu gibi diğer potansiyel testleri karşılamak için daha fazla parça (örn. 5-8) kesilebilir. Ancak, hangi çekirdek tekrarlanabilir boyutlarda kesilebilir parçaları farklı boyutta corers kullanılarak modifiye edilebilir çekirdek, gerçek boyutuna bağlı olacaktır. İsteğe bağlı olarak, tekrarlanabilir büyüklükte doku parçaları elde etmenize yardımcı olacak bir yolu, onları küçük parçalar halinde parsellenmesi daha önce bir cetvel kullanarak çekirdek uzunluğu bile. Protokolü, diğer virüslerin doğal karşılamak için değiştirilebilir ve dokuların canlı olmalı ve en fazla 6 gün için çoğaltma desteği bulduk. Protokol cytrokines dahil olmak üzere diğer viral ifade transgenlerin ölçümleri daha uzatılabilir. Aşağıdaki enfeksiyon, dokularda immünohistokimyasal yöntemler, doku histolojisi daha da geliştirilmesini sağlar ve nasıl viral enfeksiyon 10-12 daha fazla kesit ve boyama için parafine olabilir .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Yüksek glikoz DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> NorthBio Inc. </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin B çözümü </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> % 0.1 </td></tr><tr><td> Pennicilin-Streptomisin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Alamar Mavi </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferase potasyum tuzu </td><td> Moleküler Görüntüleme Ürünleri </td><td> D-luciferase potasyum tuzu 1g </td><td> PBS içinde yeniden süspanse 0.22 mikron filtre 10 mg / ml ve filtre </td></tr><tr><td> MEM tozu </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Kullanmadan önce filtre 0,22 mikron 2X MEM ve filtre yapmak için önerilen yarım hacmi olun </td></tr><tr><td> Karboksimetil selüloz (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Deiyonize su ve otoklav% 3&#39;lük bir çözüm olun. Not tozu tekrar süspansiyon için biraz zaman alabilir </td></tr><tr><td> Coomassie Brillant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm Biyopsi yumruk </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Çift Kenar Hazırlık Bıçaklar </td><td> Personna Medikal Bakım </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan diseksiyon Mikroskop </td><td> Leica </td><td> Model M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> In vivo görüntüleme sistemi (IVIS) </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> IVIS ® 200 serisi </td><td></td></tr><tr><td> Doku Tearor </td><td> Biospec ürünler </td><td> modeli 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo enfeksiyon oncolytic virüsler canlı doku

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Virüsler (OVS) seçici çoğaltmak ve tümör hücreleri öldürmek 1 roman terapötikler. HSV, Reovirus ve kanser tedavisi olarak Vaccinia OVS oncolytic platformları da dahil olmak üzere çeşitli etkinliğini değerlendiren birçok klinik çalışmalar halen devam etmektedir 2-5. Oncolytic virüslerin bir önemli özelliği de genetik mikroskopi veya biyo-lüminesans görüntüleme 6,7 dokuların enfeksiyonu görselleştirmek mümkün kılan muhabiri transgenlerin ifade değiştirilmiş olabilir . Başarılı oncolytic virotherapy 8 olasılığını araştırmak üzere tedavi öncesi hasta ex vivo olarak dokuların enfekte mümkün olduğundan bu benzersiz bir avantaj sunmaktadır. Bu amaçla, uygun doku heterojenite telafi etmek ve doku canlılığı, özellikle önceden enfeksiyonu 9 değerlendirmek için doku örneği için kritik öneme sahiptir. Viral replikasyon yanı sıra, prematüre ve üretken enfeksiyon arasında ayrımcılık için homojenizasyon aşağıdaki dokulara doğrudan titrasyon oncolytic platformu tarafından ifade, muhabir transgenlerin kullanarak takip etmek de önemlidir. Bu protokolün amacı, bu sorunları ele almak ve burada 1 açıklanmaktadır. 2 hücre kültürü için tümör dokusu numune alma ve hazırlama. Metabolik boya Alamar mavi 3 GFP veya ateşböceği lusiferaz 4 ya da ifade vaccinia virüs kültürlü dokuların ex vivo enfeksiyon kullanarak doku canlılığının değerlendirilmesi. Floresan mikroskopi veya Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) 5 kullanarak transgen ifade Algılama. Plak yöntemi ile virüs Niceleme. Bu kapsamlı bir yöntem doku işleme kolaylığı, doku heterojenite tazminat, doku canlılığı kontrolü, ve prematüre enfeksiyon ve kemik niyetli viral replikasyon arasında ayrımcılık da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunuyor.

Oncolytic virüsler kanser tedavileri için umut vericidir. Tedavisi öncesinde hastalar elde edilen canlı doku örneklerinin infectability tespit etmek için bu tedavi yaklaşımı yeteneği benzersiz bir avantaj. Bu protokol için dokuların süreci anlatılmaktadır<em&gt; Ex vivo</em&gt; Oncolytic virüs ve sonraki viral kantifikasyon enfeksiyonu.

Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Onkolitik Virüsler (OV'ler), seçici olarak tümör hücreleri içinde replike olan ve bu hücreleri öldüren yeni terapötiklerdir1. Etkinliğini değerlendiren birçok klinik çalışma...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, cerrahi müdahale sonrası elde edilen taze dokularda onkolitik vaccinia virüsünün replikasyonunu gözlemlemektir. Bu, doku heterojenliğinden kaynaklanan yanlılığı en aza indirmek için dokudan hücre kültürü örneklemesi yapılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, virüs enfeksiyonu öncesinde başlangıç materyalinin kalitesini garanti altına almak amacıyla doku canlılığı değerlendirilir.Ardından viral trend gen ekspresyonu izlenir ve viral titler belirlenir. Canlı cerrahi örneğin üretken vaccinia enfeksiyonunu destekleyip destekleyemeyeceğini değerlendirmek amacıyla, floresan protein veya biyolüminesans raporlayıcı ekspresyonunun gözlemlenmesine ve viral titerin zamanla artışına dayanarak dokulardaki vaccinia replikasyonunu gösteren sonuçlar elde edilir.Merhaba, ben Jean Simone Diallo. Bu tekniğin etkileri, onkolitik virüsler kullanılarak yapılacak tedaviye uygun olabilecek hastaların belirlenmesine yol açabileceği için kanser tedavisine kadar uzanmaktadır. Merhaba, ben de Naomi.Bu yöntem, onkolitik vaccinia virüsü kullanılarak tümör dokularının enfekte edilebilirlik durumuna dair bilgi sağlayabilir. Ayrıca, küçük modifikasyonlarla veziküler stomatitis virüsü gibi diğer onkolitik virüslere ve muhtemelen herpes simplex virüsü, adenovirüs ve Rio virüsü gibi diğer virüslere de uygulanabilir. Merhaba, ben Dominic.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, dokulardan tekrarlanabilir şekilde kor örnekler almanın zor olabilmesi ve bu örnekleri küçük ve eşit parçalara bölmenin zorlayıcı olabilmesi nedeniyle güçlük çekebilirler. Merhaba, ben John Bell; bugünkü prosedürü laboratuvarımdaki iki parlak genç lisansüstü öğrencim, Naomi DeSilva ve Dominic Wa uygulamalı olarak gösterecekler. Onlara Ottawa Hastanesi'nden cerrahi asistanı Derek Butterwick yardımcı olacak. Laminar akışlı hücre kültür kabininde çalışın. Doku örneğinin çeşitli bölgelerinden kor doku elde etmek için iki milimetrelik bir biyopsi punch'ı kullanın.Her bir doku örneğini, bir pipet yardımıyla, PBS içeren ters çevrilmiş bir Petri kabının kapağına yerleştirin; gerektiğinde örneği ayarlamak için pens kullanın. Örneklerin yatay eksen boyunca kolayca kesilebilmesi için aralarında yeterli boşluk bırakın. Her bir doku örneğini dört eşit çeyreğe bölmek için sterilize edilmiş bir jilet kullanın.Ardından, bir pipet ucu kullanarak her bir çeyrek parçayı, iki mililitre besiyeri içeren 24 kuyucuklu bir plakanın dört ayrı kuyucuğuna yerleştirin. İkinci bir doku örneğinin her bir çeyrek parçası için aynı işlemi tekrarlayın ve bu parçaları 24 kuyucuklu plakanın aynı dört kuyucuğuna yerleştirin. Tüm doku örnekleri plakaya yerleştirilene kadar bu şekilde devam edin.Tüm doku örneği çekirdekleri kuyucuklara yerleştirildikten sonra, doku içeren kuyucuklardan birine ve bir kontrol kuyucuğuna 25 µL alamar blue ekleyin ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de en az bir saat inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, alamar blue ile işlem görmüş her kuyucuktan üç adet 100 µL'lik alikot alın ve bunları 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Aynı kuyucuklardan alınacak iki adet 100 µL'lik ek alikot ile işlemi tekrarlayın.Alamar blue sinyalini floresan plaka okuyucu kullanarak okuyun ve verileri kaydedin. Bir pipet ucu kullanarak, alamar blue ile işlem görmüş kuyucuklardaki her bir doku parçasını 24 kuyucuklu plakanın temiz medya içeren bir kuyucuğuna aktarın. Örnekle birlikte yüksek miktarda medya aktarmaktan kaçının.Ardından, doku içeren kuyucuklardan birine 25 µL besiyerinde seyreltilmiş altı plak oluşturucu birim GFP eksprese eden vaccinia virüsü ekleyin. Daha sonra başka bir kuyucuğa altı plak oluşturucu birim lusiferaz eksprese eden vaccinia virüsü ekleyin. Plakayı, enfeksiyondan sonra 72 saat boyunca %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.Önceki analiz örneğine 25 µL alamar blue ekleyin. %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, üç adet 100 µL'lik örnek alın ve daha önce olduğu gibi floresan plaka okuyucuda analiz edin.Öncelikle, GFP eksprese eden vaccinia virüsü ile işlem görmüş kuyucuktaki besiyerini aspire edin ve kuyucuk içinde doğrudan PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, floresans özellikli bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, doku parçasının 40 kat uygun çözünürlükte faz kontrast görüntüsünü alın.Ardından, floresan moda geçin ve GFP uyumlu bir filtre kullanın. GFP transduksiyonu yapılmış dokudaki GFP ekspresyonunu gözlemleyin. Son olarak, ilgilenilen transgenin dalga boyundan mümkün olduğunca uzak olan başka bir dalga boyu için floresan filtre kullanın.Ardından arka plan floresansının fotoğrafını çekin. Sonrasında, pipet uçlarını kullanarak doku parçalarını toplayın. Dokuyu tartın.Bu ölçüm, prosedürün sonunda virüs titresini gram başına oluşturucu birim cinsinden hesaplamak için kullanılacaktır. Gelecekteki titreleme işlemleri için dokuyu -80 °C'de saklayın. Lusiferaz eksprese eden vaccinia virüsü ile transduksiyonu yapılan kuyucuğa ve sadece doku kültürü ortamı içeren bir kuyucuğa 10 mg/mL konsantrasyonunda beş µL lusifer substratı pipetleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Plakayı in vivo görüntüleme sistemine yerleştirin ve pozlama süresini beş saniyeye ayarlayın. Lusiferaz eksprese eden vaccinia virüsü ile transdukte edilmiş kuyucukların fotoğrafını çekin. Görüntü doygun görünüyorsa prosedürü daha kısa bir pozlama süresiyle tekrarlayın veya sinyal gözlenmezse daha uzun bir pozlama süresi kullanın.Kuyu başına tam besiyerinde 1 milyon canlı U2 OS hücresi içeren altı kuyucuklu bir plaka hazırlayın ve kuyucukların ertesi gün %95 konfluense ulaşması için 37 °C'de %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Daha önce tartılmış olan enfekte doku örneklerini alın. Örnekleri beş ml'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir ml PBS ekleyin.Dokuyu homojenize etmek ve viral partikülleri açığa çıkarmak için bir doku homojenizatörü kullanın. Ardından, 100 µL doku homojenatı viral süspansiyonunu 900 µL serumsuz medyuma aktararak ve işlemi gerektiği kadar tekrarlayarak, serumsuz medya içinde doku homojenatı viral süspansiyonunun 1/10'luk seri dilüsyonlarını hazırlayın. Daha sonra U2 OS hücrelerini içeren altı kuyucuklu plakadaki medyumu aspire edin.Her bir seri dilüsyondan 500 µL'yi plaka kuyucuğuna pipetleyin. Hücreler inkübe olurken hücrelerin kurumasını önlemek için plakaları her 15 dakikada bir hafifçe sallayarak plakayı bir saat boyunca doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. %20 FBS içeren 2X DMEM şişesini ve %3 CMC çözeltisi alikotunu 37 °C'lik su banyosunda ısıtın. Isındıktan sonra, %1,5 CMC ve %10 FBS nihai konsantrasyonlarına ulaşmak için %3 CMC ile %20 FBS'li 2X DMEM'in bire bir karışımını hazırlayın.İnkübasyonun ardından, U2 OS hücrelerindeki besiyerini aspire edin ve her kuyucuğa 2 mL %1,5 CMC %10 F-B-S-D-M-E-M karışımı ekleyerek plakayı daha fazla 48 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. 48 saat sonra, her kuyucuktaki CMC besiyeri karışımına 2 mL metanol asetik asit fiksatörü ekleyin ve plakayı doku kültürü steril kabininde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon süresi dolduğunda, her bir kuyucuktaki solüsyonu aspire edin. Kalan fiksatifleri uzaklaştırmak için her kuyucuğu musluk suyuyla iyice yıkayın. Ardından, her birine iki mililitre kumasi blue solüsyonu pipetleyin.Ardından, plakayı bir çalkalama platformuna yerleştirin ve düşük hızda çalkalayarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin, kuyucuktaki kumasi blue çözeltisini aspire edin ve musluk suyu ile durulayın. Kapağı açık olan plakayı kuruması için çeker ocakta yaklaşık bir saat bekletin. 10 ile 100 arasında plağın görüldüğü dilüsyon basamağındaki viral plakları sayın.Sayılan plak sayısını kullanılan dilüsyon faktörü ile çarpın ve ardından, mililitre başına plak oluşturan birim cinsinden titreyi elde etmek için çıkan sonucu iki ile çarpın. Dahası, bunu gram başına plak oluşturan birim cinsinden raporlamak için bu sayıyı örneğin başlangıçta ölçülen ağırlığına bölün. Bu grafik, toplama sonrası ikinci ve 72. saatlerde alamar blue sinyal yoğunluğu ile ölçülen doku canlılığını göstermekte olup, hem normal hem de tümör dokusunun en az 72 saatlik bir süre boyunca metabolik olarak aktif kalabildiğini ortaya koymaktadır.Bu temsilci veriler, enfeksiyondan sonraki iki ve 72. saatlerde gram başına doku örneğinden toplanan vaccinia virüsünün titrelerini göstermektedir. Bu durum, virüsün kendi kendini çoğaltmaya ve yayılmaya yol açan üretken bir viral yaşam döngüsü geçirdiğini göstermektedir. Bu görüntü, hasta vaccinia virüsünden elde edilen tipik bir lüminesans sinyalini örneklendirmektedir.In vivo görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülenen lusiferaz enfekte doku örnekleri. Yoğun lüminesans bölgeleri, sağdaki lüminesans ölçek çubuğuna göre kırmızı görünmektedir; faz kontrast ve GFP kanalı floresan mikroskopi görüntülerinin karşılaştırılması, vaksinya virüsü GFP tarafından transdukte edilen doku oranını göstermektedir. Kırmızı kanalda sinyal olmaması, floresan sinyalinin özgüllüğünü göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, taze doku kullanmaya ve prosedür boyunca dokunun mümkün olduğunca temsilci alanlarından örnek almaya özen göstermek önemlidir. Virüsün spesifik olarak hangi doku yapılarını enfekte ettiği ve virüsün gen ekspresyonu üzerindeki etkisinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, titrasyon yerine doku fiksasyonu, immünohistokimya, DNA veya RNA ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, vaccinia virüsü ile ex vivo enfeksiyonlar için örnekleri nasıl işlediğimiz ve virüsün yayılımını GFP veya Luciferase transgenlerinin ekspresyonu aracılığıyla nasıl takip ettiğimiz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Ve son olarak, işlem örneklerinden bir virüsün nasıl titre edildiğini göreceğiz. Canlı virüslerle çalışmanın, suşa bağlı olarak tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve uygun laminar akış kabininde çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makale, gen teslimat çalışmaları ve IVIS biyoparlaklık görüntüleme kullanarak gen ekspresyonu sonraki analiz için hasta doku dilim kültür açıklar.

Hasta Doku ve Gen Teslimat Sınav Ex Vivo Kültür

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Kurulmuş kanser hücre hatları ve ksenogratflardır son birkaç yıldır kanser araştırma dayanak noktası olmuştur. Bununla birlikte, son bulgular terapötik tepki özellikle, tümör hücre mikro-ortamı tarafından etkilendiğini göstermektedir. Bu nedenle, ilaç geliştirme amaçları için primer tümör numunelerinin bir ex vivo analiz geliştirdik.

İlköğretim Tümörleri ve / veya klinik öncesi için İlişkili Metastazlarının ve Tedavi Klinik Geliştirme Ex Vivo Tedavisi Tepki

Pamuk fareleri son derece heyecanlıdır ve güçlü bir kaç ya da savaş tepkisine sahiptir. Hayvanların stresini azaltmak için optimize edilmiş bir işleme yöntemi tanımlanmıştır, bu da pamuk farelerini klinik öncesi bir model olarak daha erişilebilir hale getirecektir.

Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma

Onkolitik viroterapiler, hepatosellüler karsinom (HCC) tedavisinde yeni terapötikler olarak geliştirilme aşamasındadır.  Burada, onkolitik virüsün hepatik arteriyel uygulaması yoluyla HCC'nin lokorejyonel tedavisi için bir yöntem tanımlanmıştır.

Sıçanlarda Ortotopik HCC Lokorejyonel Tedavisi için oncolytic virüs transarteryel İdaresi

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Öğrenin, onkolitik vaccinia virüsü ile taze cerrahi dokuların ek vivo enfeksiyonunu ve viral çoğalmayı GFP/biyolüminesans görüntüleme ile nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, kanser tedavisi için hasta seçimine rehberlik eder.

Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Daha fazla video keşfet