Name: Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Öğrenin, Candida albicans barkodlu mutant kütüphaneleri kullanarak gen-ilaç etkileşimlerini yüksek verimli tarama yöntemleriyle nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol fonksiyonel genomik araştırmalar için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Ron Davis, Adam Deutschbauer, ve tüm HIP HOP laboratuar Toronto Üniversitesi&#39;nde tartışmalar ve öneriler için teşekkür ederim. CN, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü (Grant Numarası HG000205), RO1 HG003317 CIHR MOP-84.305, ve Kanada Kanser Derneği (020.380) hibe ile desteklenmektedir. JO Stanford Genom Eğitim Programı (Hibe Numarası T32 HG00044 Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (Hibe Numarası P01 GH000205) tarafından desteklenmiştir. GG, Kanadalı Dr Yenilik Vakfı hibe tarafından kısmen desteklenen NHGRI RO1 HG003317 ve Kanada Kanser Derneği, Grant # 020.380, TD ve Donnelly Sıralama Merkezi tarafından desteklenmektedir. Brenda Andrews ve Jack Greenblatt. AMS, Toronto açın Bursu bir Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, biz Etiketli mutant koleksiyonları oluşturmak için farklı mikroorganizmaların barkodlu mutant koleksiyonları mevcut koleksiyonları geniş bir yelpazede kolayca adapte edilebilir, mütevazı bir değişiklik ile bir protokol sıraladı. Patojenik maya C etiketli transposon mutagenez bir protokol bildirdin Biz vurgulamak albicans, çok benzer bir protokol, tek hücreli mantarlar geniş bir yelpazede adapte olabilir . Modifiye Bu protokol, bakteri 13 iyi çalışıyor ve şu anda ek fungal ve bakteriyel genomların bir dizi koleksiyonları yapım aşamasındadır . Şu anda, bu testte, gen-küçük molekül etkileşimleri için tek kapsamlı, genom tarafsız ekran sağlar. Testinin özellikle ikna edici bir özelliği gen ya da küçük molekül hiçbir ön bilgi gerekli olmasıdır. Bu testlerin kapsam ve gücüne rağmen, diğer laboratuarlara aktarılabilirliği sonuçların analizi için başlangıç ​​sermayesi yatırım ve bilişim araçları ile biraz engellemiştir. Analizi için güçlü araçlar ile birlikte bir sonraki nesil dizisi okuma kabulü ile, onların evlat edinme artmasını bekliyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiyotikler </td><td> Satıcı ve katalog numaraları </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Sigma, part # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Sigma, part # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycin </td><td> Sigma, part # S0692 </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Sigma, part # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Temizlik-up ve konsantrasyon kitleri </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kiti </td><td> Qiagen, part # 27.106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plazmid Maxi Seti </td><td> Qiagen, part # 12.663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Arıtma Kiti </td><td> Qiagen, parçası # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Jel Ekstraksiyon Seti </td><td> Qiagen, part # 28.704 </td></tr><tr><td> PCR ve elektroforez reaktifler </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polimeraz (Mg-serbest) Tampon </td><td> New England Biolabs, part # M0320L </td></tr><tr><td> Deoksinükleotid Çözüm Mix </td><td> New England Biolabs, part # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, part # 63.036 </td></tr><tr><td> Agaroz yükleme, boya, ve nükleik asit jel elektroforezi için uygun leke </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 10X TAE tampon </td><td> Sigma, part # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus DNA Ladder </td><td> Invitrogen, parçası # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD suyu </td><td></td></tr><tr><td> 10 g maya özü </td><td> Sigma, part # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto pepton </td><td> BD Biosciences, part # 211.677 </td></tr><tr><td> 20 g dekstroz </td><td> Sigma, part # D9434 </td></tr><tr><td> Laboratuvar </td><td></td></tr><tr><td> Çok kanallı pipetler (1000, 200, ve 20 mcL) </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık pipetleme rezervuarları </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 15 ve 50 ml santrifüj tüplerine </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 96 - ve 384-Eh Derin Şey Tabaklar </td><td> Axygen Bilimsel parçası # P-2ml-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-ve 384-iyi PCR plakaları ve mühür filmi </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Plaka silindir, conta çok iyi plakaları için </td><td> Sigma, part # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C ve 37 ° C plakalar üzerinde bakteri ve maya büyüyen ve tüpler sallayarak inkübatörler </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> In vitro transpozon mutagenez </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 Transposase </td><td> Epicentre Biyoteknoloji, part # TNP92110 </td></tr><tr><td> Yüksek verim dönüşüm </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plazmid Hazırlık Seti </td><td> Kenar Biosystems, part # 84.359 </td></tr><tr><td> polietilen glikol, moleküler ağırlığı 3350 </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Lityum asetat </td><td> Sigma, part # 517.992 </td></tr><tr><td> Steril, tabak 6-iyi </td><td> Corning, part # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml üridin </td><td> Sigma, part # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA tampon çözelti </td><td> Sigma, part # T9285 </td></tr><tr><td> 1x TE/0.1M LiOAc </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> somon testis DNA </td><td> Sigma, part # 1626 </td></tr><tr><td> Barkodlu koleksiyonları Büyüme </td><td></td></tr><tr><td> 48 kuyucuğu; plakalar kültürlerin büyüyen eğer </td><td> Greiner, part # M9437 </td></tr><tr><td> Yapışkan levha contaları </td><td> ABgene, kısmen # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 mL kültür matara </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Absorbans yetenekli Spektrofotometre </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> 250 ml&#39;lik şişeler veya sallayarak spektrofotometre ısı kontrollü çalkalayıcı </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Güvenli-Lock Mikrosantrifüj Tüp, 2 mL </td><td> Eppendorf, kısmen # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hibridizasyon ekipman </td><td></td></tr><tr><td> Hibridizasyon Fırını 640 </td><td> Affymetrix, part # 800.138 </td></tr><tr><td> GeneChip akışkan İstasyonu 450 </td><td> Affymetrix, parça # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Tarayıcı 3000 </td><td> Affymetrix, parça # 00-0212 </td></tr><tr><td> Kayan kabinle birlikte Kaynar su banyosu </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Hibridizasyon sarf </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Etiket 16K Dizi v2 </td><td> Affymetrix, part # 511.331 </td></tr><tr><td> Denhardt Çözüm 50X konsantre </td><td> Sigma, part # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, Ar-fikoeritrin konjuge (SAPE) </td><td> Invitrogen, part # S866 </td></tr><tr><td> Güvenli-Lock Mikrosantrifüj Tüp, 0,5 mL </td><td> Eppendorf, kısmen # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Ufacık Tough-Spotlar </td><td> Çeşitlendirilmiş Biotech, part # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> BioRad, part # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, part # T2700 </td></tr><tr><td> MES serbest asit monohidrat </td><td> Sigma, part # M5287 </td></tr><tr><td> MES sodyum tuzu </td><td> Sigma, part # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, part # 71.386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, part # S2015 </td></tr><tr><td> Moleküler biyoloji notu suyu </td><td> Sigma, part # W4502 </td></tr><tr><td> Hibridizasyon Astarlar </td><td> Çeşitli tedarikçileri (standart tuzsuzlaştırma) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotin GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotin GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotin CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;3 GTCGACCTGCAGCGTACG&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 3 5&#39;CTACGAGACCGACACCG &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sıralama Astarlar: Illumina Platformu </td><td> Çeşitli tedarikçilerden </td></tr><tr><td> UpTag İleri (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Ters (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T nnnnn GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag İleri (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Ters (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T nnnnn CGG TGT CGG TCT CGT AG, 3 ` </td></tr><tr><td> 1 okuyun UP-tag sıra astar (100uM) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 AŞAĞI-etiket sıra astar (100uM) </td><td> 3 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG&#39; </td></tr><tr><td> 2 Endeksi Sıralama astar (standart Illumina R1 astar) (100uM) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Ek Sıralama Reaktifler / Ekipman </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR arıtma Takımı </td><td> Qiagen, part # 29.051 </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> Herhangi bir satıcı </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vakum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, kısmen # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, part # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit tahlil tüpleri </td><td> Invitrogen, part # Q32856 </td></tr><tr><td> % 40 akrilamid artı% 1 N, N&#39;-metilen-bis-akrilamid, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, part # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Borik Asit </td><td> Sigma, part # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8.0 </td><td> Teknova, part # E0306 </td></tr><tr><td> Amonyum persulfate </td><td> Sigma, part # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, part # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidium Bromür Çözümü </td><td> Bioshop, part # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M amonyum asetat </td><td> Teknova, part # A2000 </td></tr><tr><td> 10mM Magnezyum asetat tetrahidrat </td><td> Sigma, part # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mm EDTA, pH 8.0 </td><td> 0,5 M EDTA, pH 8.0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Sodyum asetat, pH 5.2 </td><td> Teknova, part # S0297 </td></tr><tr><td> Hız vakum </td><td> Çeşitli </td></tr><tr><td> Tek-Read Küme Üretimi Kiti </td><td> Illumina, kısmen # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> V4 36C Sıralama Seti </td><td>Illumina, part # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10x TBE tarifi <table border="1"><tbody><tr><td> Tutarlar </td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> 108 gram </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gram </td><td> Borik Asit </td></tr><tr><td> 40ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8.0) </td></tr><tr><td colspan="2"> DH 2 O 1L işareti </td></tr></tbody></table> % 12 Poliakrilamid jel tarifi <table border="1"><tbody><tr><td> Hacimleri </td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> 5.8 ml </td><td> % 40 akrilamid artı% 1 N, N&#39;-metilen-bis-akrilamid, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> % 10 amonyum persülfat </td></tr><tr><td> Toplam hacmi: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag astar karışımı: Süspanse edin Uptag ve GKD 2 O Buptagkanmx4 her 100 mcM, daha sonra her biri 50 mcM nihai bir konsantrasyon 1:1 oranında karıştırın . -20 ° C&#39;de muhafaza Downtag astar karışımı: Süspanse edin Dntag ve Bdntagkanmx4 her biri 100 mcM GKD 2 O, sonra 50 mcM her son bir konsantrasyon için 1:1 oranında karıştırın . -20 ° C&#39;de muhafaza Karışık oligonükleotidler: 100 mcM GKD 2 O her aşağıdaki sekiz oligos (standart desalted) süspanse edin: Uptag,,, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. 12.5 mcM her son bir konsantrasyon için sekiz oligonükleotidler bir eşit miktarda karıştırın. 12X MES stok: 10 ml için 0.7 g MES serbest asit monohidrat ve 1.93 g MES sodyum tuzu, 8 ml moleküler biyoloji notu su çözülür. Iyi karıştırıldıktan sonra, pH ve pH 6,5-6,7 gerekirse ayarlayabilirsiniz. Toplam hacim 10 ml su ekleyin. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C ışığı (örneğin, folyo tüp sarın) karşı korumalıdır. Çözüm, gözle görülür bir şekilde sarı veya 6 ay sonra hale gelmesi durumunda değiştirin. 2X Hibridizasyon tamponu: 50 ml, 8.3 ml (2.9.14) 12X (MES) hisse senetleri, 5 M NaCl, 4.0, 0.5 M EDTA, 0.1 ml% 10 Tween 20 (hacim / hacim) ml, ve 19.9 ml GKD süzülmüş 17.7 ml karıştırmak 2 O. Sterilize Filtresi. A Yıkama: Mix 300 ml 20X SSPE, 1 ml% 10 Tween (hacim / hacim), 699 ml GKD 2 O. Sterilize Filtresi. Yıkama B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 ml% 10 Tween (hacim / hacim), 849 ml GKD 2 O. Sterilize Filtresi. Barkod sıralama primerler UP-etiket astar dizileri 5 &#39;kuyruk (kalın), F ve R astar dahil Illumina belirli bir bağdaştırıcı dizileri . Değişken dizisi (italik), dizin / çoğullama okuma kullanılan 5-mer indeksleme etiketi temsil eder . 3 &#39;kuyruk (altı çizili) uptag barkod kuşatan ortak astar temsil eder ve maya barkod yükseltmek için gereklidir. AŞAĞI-tag astar 5 Ancak, 3 &#39;kuyruk (altı çizili) yükseltmek için kullanılan ortak primerler ile değiştirilir, UP-tag primerler (Illumina dizisi) kuyruk kuyruk 5 özdeş&#39; dizileri AŞAĞI etiketi barkod.

barkodlu maya kütüphaneler rekabet genomik ekranlar

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Yeni nesil sıralama teknolojilerindeki gelişmeler sayesinde, neredeyse her gün yeni gen dizilimlerini erişimi var. Bu gelişmelerin temposu hızlanıyor, daha fazla derinlik ve genişlik umut verici. Bu olağanüstü gelişmelerin ışığında, genin işlevini tanımlamak için hızlı, paralel yöntemleri için ihtiyaç her zamankinden daha önemli hale gelir. Maya ve E. genom silme mutantlar koleksiyonları coli gen fonksiyon fonksiyonel karakterizasyonu için beygirleri olarak hizmet etmiş, ancak bu yaklaşım ölçeklenebilir değildir, mevcut gen silme yaklaşımları silinir ve doğrulanabilir bir genomu oluşturan genlerin her biri binlerce gerektirir. Bu çalışma tamamlandıktan sonra, biz yüksek verim fenotipleme takip edebilirsiniz. Geçtiğimiz on yıl boyunca, laboratuar, rekabetçi, minyatür, yüksek verimli genomu paralel olarak yapılabilir testleri geniş bir portföy rafine vardır. Bu paralelizasyon barkod mutasyonu için bir vekil olarak hizmet, çünkü DNA &#39;etiketler&#39;, ya da her bir mutant haline &#39;barkod&#39; dahil edilmesi mümkündür ve bir mutant spor değerlendirmek için barkod bolluk ölçebilirsiniz. Bu çalışmada, DNA dizisi ve barkodlu mutant koleksiyonları arasındaki boşluğu doldurmak için çalışırlar. Bunu başarmak için yeni dizisi paralel barkod deneyleri kadar açılır, ancak zayıf mikropların karakterize bir kombine transposon kesintisiz barkodlama yaklaşımı tanıtmak. Bu yaklaşım göstermek için yeni bir Candida albicans barkodlu bozulması koleksiyonunu sergilemek ve hem mikroarray tabanlı ve yeni nesil sıralama tabanlı platformlar 10,000 toplamak için nasıl kullanılabileceğini tarif - 1.000.000, gen-gen ve ilaç-gen etkileşimleri tek bir deney .

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Yeni nesil dizileme teknolojilerindeki ilerlemeler sayesinde, neredeyse her gün yeni genom dizilerine erişim sağlıyoruz. Bu ilerlemelerin hızı...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimlerini oldukça paralel bir şekilde anlamak için genom genelinde barkodlanmış mikrop koleksiyonlarını kullanmaktır. Bu, hücrelerin eksponansiyel büyümede tutulması için robotik sistemler kullanılarak, mikrop koleksiyonunun bir ilaç varlığında beş ila 20 nesil boyunca büyütülüp taranmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, aynı anda 4.000 ila 6.000 bireyden genomik DNA çıkarılmasını sağlayan hücre toplama işlemi yapılır.Amplifiye edilmiş barkodları içeren sonraki PCR ürünleri, barkodları nicelendirmek ve böylece karmaşık bir havuzdaki her bir suşun bolluğunu belirlemek için mikroarray hibridizasyonu veya barkod dizileme kullanılarak nicelendirilir. Nihayetinde, hangi barkodlu mutantların tedavilere duyarlı olduğu ve bu nedenle deney süreci boyunca havuzdan eksildiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bugün göreceğimiz tekniğin temel avantajı, suşlarla plaklar üzerindeki koloniler veya buradaki tekil sıvı kültürler şeklinde tek tek ilgilenmek yerine, on binlerce veya yüz binlerce farklı suşu bir araya getirip tek bir havuz olarak analiz edebilmemizdir.Bu analizin gücünü fark ettiğimizde onu otomatik hale getirmemiz gerekti ve şanslıyım ki Stanford Genom Teknolojisi sensöründe çalışıyordum ve bunu başarmamı sağlayan mühendislerle çevriliydim. Bugün protokolü uygulamalı olarak gösterecek olan kişiler, tüm protokolleri ve ilgili prosedürleri adım adım anlatacak olan laboratuvarımdaki kıdemli lisansüstü öğrencisi Andrew Smith ve protokolün sekanslama kısımlarının nasıl yapılacağını gösterecek olan Tanya Durick'tir. Bu protokol, her bir mutantın bireysel mutantları tek bir havuzda birleştirmek için bir barkod etiketi taşıdığı, transpozon mutajenezi ile oluşturulmuş bir Canada albicans mutant kütüphanesini kullanmaktadır. Kütüphanenin bir kopyası 3 84'e replike edilir.Besiyeri içeren kuyucuklu plaklarda koloniler, maksimum boyuta ulaşana kadar 30 °C'de iki ila üç gün boyunca büyütülür. Ardından, bek alevi ve steril laboratuvar ekipmanları kullanılan bir mikrobiyoloji ortamında, her tepsi 5-10 mL besiyeri ile doldurulur ve beş dakika boyunca bekletilir. Koloniler bir hücre yayacağı yardımıyla süspanse edilir ve hücreleri içeren sıvı, 50 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne aktarılır.%7 DMSO içeren besiyeri ile hücreleri nihai OD 600 konsantrasyonu mililitre başına 50 olacak şekilde ayarlayın, ardından PCR şerit tüplerine 40 µL hacimlerde paylaştırın; havuzlanmış hücre alikotları -80 °C'de süresiz olarak saklanabilir. Bu prosedüre başlamak için, havuzlanmış hücre alikotlarını buz üzerinde çözdürün ve havuzu seçilen bir ilaç veya koşul içeren besiyerine nazikçe seyrelterek, bir 48 kuyucuklu plakanın her kuyucuğunda toplam 700 µL hacimde 0,0625 OD 600 olacak şekilde inoküle edin. Bu video kapsamında, iki koşulun üçer tekrarı hazırlanacaktır.Plakada en az bir uygun çözücü kontrolüne yer verin. Plağı plastik bir plaka sızdırmazlık filmiyle kapatın ve hücreleri bir spektrofotometrede veya sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda, deneysel olarak belirlenmiş bir çalkalama rejimiyle 30 degrees Celsius sıcaklıkta büyütün. Örneğin, 14 dakika boyunca çalkalayın, kuyucukları bir dakika boyunca okuyun ve ardından çalkalamaya devam edin.Hücre süspansiyonunun bir kısmı robot tarafından hasat edilebilir ve robotik güvertedeki bir soğutucu plakada saklanabilir. Kullanıcı tarafından tanımlanan jenerasyon zaman noktalarında, tipik olarak 5, 10, 15 ve 20 büyüme jenerasyonunda işlem yapın. Her örnek ve zaman noktası için en az iki od 600 hücre hasat edin.Hasat edilen hücre örneklerini güvenli kilitli mikro santrifüj tüplerine aktarın. Bu hücreler daha sonra, bu prosedürü başlatmak için aşağıda gösterilecek olan genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılabilir. Bir yeast star kiti ile çeşitli zaman noktalarında hasat edilen hücrelerden saflaştırılmış genomik DNA.Üretici talimatlarına göre, bir modifikasyonla, DNA'yı 300 µL 0.1 XTE ile elüe edin. Ardından, her örnek için iki PCR reaksiyonu hazırlayın: Biri UPT etiketleri, diğeri ise down etiketleri için.Elde edilen PCR ürünlerini bir jel üzerinde kontrol edin. Birinci ve üçüncü şeritlerde gösterilen hibridizasyon için kullanılan amplikonlar için her iki PCR'da da 60 baz çiftlik bir ürün beklenir. Bu örnekte, beşinci ve yedinci şeritlerde gösterilen barkod sekanslama amplikonları için 130 baz çiftlik bir ürün beklenmektedir.Bu aşamada, hangi PCR ürününün oluşturulduğuna bağlı olarak, PCR ürünleri ya mikroarray analizi ya da doğrudan barkod dizileme için kullanılabilir. Mikroarray analizine hazırlanmak için hibridizasyon fırını sıcaklığını 42 °C'ye önceden ısıtın; kaynar su banyosu ve buzlu su karışverişi içeren bir buz kovası hazırlayın. Arrayleri, 120 µL bir x hibridizasyon tamponu ile yavaşça doldurarak önceden ıslatın.Dizileri, hibridizasyon tamponu içerisinde 42 °C'de ve 20 RPM'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Diziler inkübe olurken, her tüpe 120 µL hibridizasyon karışımı içeren kilit kapaklı 0,5 mL tüpler hazırlayın. Her örnek için bir adet ve yedek olarak bir adet fazladan tüp hazırlayın. Toplam hacmi 150 µL'ye tamamlamak için hibridizasyon karışımına 30 µL uptake PCR ve 30 µL down tag PCR ekleyin.İki dakika boyunca kaynatın ve en az iki dakika boyunca buzlu suda bekletin. Kullanmadan önce tüpleri kısa süreliğine santrifüjleyin. Dizilerden ön hibritleme tamponunu uzaklaştırın ve buharlaşmayı önlemek için 120 µL hibritleme PCR karışımı ekleyin.Dizi contalarını bir koruyucu örtü ile kapatın, 42 °C'de ve 20 RPM'de 16 saat boyunca hibridizasyon yapın. Dizileri hibridizasyon fırınından çıkarın ve çipler üzerindeki koruyucu örtüleri kaldırın. Hibridizasyon karışımını pipet yardımıyla dizilerden yavaşça uzaklaştırın ve dizileri doldurun.120 µL yıkama çözeltisi A ile dizileri, hazırlanan sıvı istasyonunun yıkayıcısına yerleştirin. Diziler, aşağıdaki modifikasyonlarla gene Flex SV 3 4 50 protokolü kullanılarak yıkanacaktır. Boyama öncesinde yıkama A ile bir ekstra adım eklenir.Yıkama B için 40 °C yerine 42 °C sıcaklık kullanın ve boyama işlemini akış istasyonunda 25 °C yerine 42 °C'de gerçekleştirin. Akış operasyonlarının ardından akış istasyonunu çalıştırın, four 50 protokolünü kapatın. Hava kabarcığı bulunmadığından emin olduktan sonra yıkayıcıyı boşaltın.Dizileri tarayıcıya yerleştirin ve 560 nanometre emisyon dalga boyunda tarama yapın. 130 baz çiftlik PCR ürünü, yeni nesil barkod sekanslaması için kullanılır; bunu gerçekleştirmek için önce 12'li havuz DNA örneklerini %12'lik jel üzerinde ayırın. Ardından, jeli cyber green ile boyayın ve ilgili jel bandını kesin.Jelden ekstrakte edilen DNA daha sonra gerçek zamanlı PCR ile miktarları belirlenerek, CBOT ve tek okuma küme oluşturma kiti kullanılarak tek bir okuma akış hücresinde kümeler oluşturulur. Akış hücresini sekanslayıcıya yerleştirin ve ilk bazın çıkışını gözlemleyin. Burada gösterilen sekanslayıcı, protokolün belirli noktalarında toplanan verileri temsil eden bir dizidir.Etiketlenmiş mutant havuzu, antifungal ajan clotrimazole varlığında ve kontrol olarak DMSO içerisinde 20 nesil boyunca büyütüldü; ardından her bir gen için log iki oranı hesaplandı ve grafiğe döküldü. Log iki oranı iki olan ve clotrimazole tedavisine karşı anlamlı düzeyde hassasiyet gösteren tüm suşlar kırmızı ile vurgulanmıştır. Bu örnekte NCP one, ERG two ve ERG 11'in iki bağımsız aleli olmak üzere dört suş gösterilmektedir.Birleştirilmiş bir taramada duyarlı olduğu tespit edilen antifungal ilaç clotrimazole'in bilinen protein hedefli suşlarının duyarlılığı, aynı ilaç konsantrasyonu varlığında bireysel büyüme analizleri ile doğrulanmalıdır. Bir sonraki grafik, buradaki bir konfirmasyon deneyinin sonuçlarını göstermektedir. Taramada tespit edilen dört suş, yabani tip ebeveyn suşa kıyasla azalmış büyüme göstermiştir.BWP 17 siyahla belirtilmiştir. Bu bireysel büyüme eğrileri, bu tür havuzlanmış gen ilacı taramalarının önemli bir özelliğini vurgulamaktadır; belirli bir suşun mutlak sıralaması, duyarlılığının tam seviyesini her zaman yansıtmaz. Ayrıca, sonuçlar her gen için birden fazla alele sahip olmanın değerini göstermektedir.Bu durumda, iki ERG 11 delesyon mutanı ilaca karşı hafifçe farklı hassasiyetler göstermektedir. Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik taramanın inokülasyonundan verilerin analizine kadar beş gün içinde tamamlanabilir. Dolayısıyla, her bir bireysel deney biyolojik açıdan aydınlatıcı olsa da, asıl güç, çok sayıda deney yapıp gen fonksiyonunu ve ilaç etkisini öngörebileceğiniz bir veri tabanı oluşturduğunuzda ortaya çıkar.Bu videoyu izledikten sonra, havuz taraması için genom çapında barkodlanmış mutant koleksiyonlarının nasıl hazırlanacağı ve geliştirildikten sonra ilgilenilen genleri belirlemek için mikroarray veya dizilemenin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, fonksiyonel genomik alanındaki araştırmacıların maya genomundaki 6.000 farklı genin her birinin fonksiyonunu araştırmasına olanak sağlamıştır.

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran...

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Kantitatif Spor Analizi (QFA) mikrobiyal kültür uyumu tahmin etmek için deneysel ve hesaplamalı yöntemleri tamamlayıcı bir dizi. QFA genetik mutasyonlar, uyuşturucu ya da mikrop büyümesi üzerine uygulanan diğer tedavilerin etkisi tahmin ediyor. Tek kültür odaklı analiz paralel kültürlerin binlerce deneyler ölçekleme dizayn edilebilir.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler.

İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Burada, tomurcuklanan mayadaki kimyasal-genetik etkileşimleri tanımlamak için uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yaklaşım, maya moleküler biyolojisindeki temel teknikler üzerine inşa edilmiştir ve küçük ila orta ölçekli kimyasal koleksiyonlarının ve diğer ortam ortamlarının mekanik sorgulaması için çok uygundur.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Öğrenin, Candida albicans barkodlu mutant kütüphaneleri kullanarak gen-ilaç etkileşimlerini yüksek verimli tarama yöntemleriyle nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol fonksiyonel genomik araştırmalar için güçlü bir araç sunar.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Daha fazla video keşfet