Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gen, ilaç ve gen ortamı etkileşimlerini oldukça paralel bir şekilde anlamak için genom çapında barkodlu mikrop koleksiyonlarını kullanmaktır. Bu, hücreleri üstel büyümede tutmak için robotik kullanan bir ilacın varlığında mikrop koleksiyonunun beş ila 20 nesil büyüme için taranmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, hücreler toplanır, bu da aynı anda 4.000 ila 6.000 kişiden genomik DNA'yı çıkarmamızı sağlar.

Daha sonra, amplifiye edilmiş barkodları içeren PCR ürünleri, barkodları ölçmek ve böylece karmaşık bir havuzdaki her bir suşun bolluğunu belirlemek için mikrodizi hibridizasyonu, barkod dizilimi veya barkod dizilimi kullanılarak nicelleştirilir. Sonuç olarak, hangi barkodlu mutantların tedavilere duyarlı olduğunu ve bu nedenle deney süresince havuzdan tükendiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bugün göreceğimiz tekniğin ana avantajı, burada suşları plakalar üzerinde koloniler veya tek bir sıvı kültür olarak tek tek ele almak yerine, on veya yüz binlerce farklı suşu çekip tek bir havuz olarak analiz edebilmemizdir.

Bu testin gücünü fark ettiğimizde, onu otomatikleştirmemiz gerekiyordu ve neyse ki, Stanford Genom Teknolojisi sensöründe çalışıyordum ve etrafım bunu başarmama izin veren mühendislerle çevriliydi. Bugün protokolü gösteren, laboratuvarımda son sınıf yüksek lisans öğrencisi olan ve tüm protokolleri ve ilgili prosedürleri gözden geçirecek olan Andrew Smith olacak. protokolün sıralama yönlerinin nasıl yapılacağını bize gösterecek olan Tanya Durick'in yanı sıra. Bu protokol, her mutantın tek tek mutantları tek bir havuzda birleştirmek için bir barkod etiketi taşıdığı, mutajenez üzerinde transpoze tarafından oluşturulan Kanada albicans mutantlarından oluşan bir kütüphane kullanır. Kütüphanenin bir kopyası 3 84'e çoğaltılır.

Edia içeren kuyucuk plakaları, kolonileri maksimum boyuta ulaşana kadar iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede büyütür. Daha sonra, alev ve steril LabWare ile mikrobiyoloji ortamında çalışarak, her tepsiyi beş ila 10 mililitre ortamla doldurun ve beş dakika bekletin. Resus, kolonileri bir hücre yayıcı ile askıya alın ve sıvı artı hücreleri 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne dökün.

DMSO'yu %7'ye ekleyin: Hücreleri,% 7 DMSO ve daha sonra PCR şerit tüplerinde alikot ve 40 mikrolitre hacimler içeren ortamlarla mililitre başına 50'lik bir son OD 600 konsantrasyonuna ayarlayın, havuzlanmış hücre alikotları eksi 80 santigrat derecede süresiz olarak saklanabilir. Bu prosedüre başlamak için, havuzlanmış hücre alikotlarını buz üzerinde çözün, havuzu hemen bir ilaç veya tercih edilen bir koşulla yavaşça seyreltin, 48 oyuklu bir plakada kuyu başına toplam 700 mikrolitre hacimde 0.0625'lik bir OD 600'de aşılayın. Bu videonun amaçları doğrultusunda, iki koşulun üç kopyası hazırlanacaktır.

Plakaya en az bir uygun solvent kontrolü ekleyin. Plakayı plastik bir plaka contası ile kapatın, hücreleri bir spektrofotometrede veya deneysel olarak belirlenmiş bir çalkalama rejimi ile 30 santigrat derecede çalkalayarak sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda büyütün. Örneğin, 14 dakika çalkalayın, bir dakika boyunca kuyucukları okuyun, ardından çalkalamaya devam edin.

Hücre süspansiyonunun bir kısmı robot tarafından toplanabilir ve robotik güverte üzerindeki bir kömür plakasına kaydedilebilir. Kullanıcı tanımlı üretim zaman noktalarında, genellikle 5, 10, 15 ve 20 nesil büyüme. Her numune ve zaman noktası için en az iki veya 600 hücre hasat edin.

Hasat edilen hücre örneklerini güvenli kilitli mikro santrifüj tüplerine aktarın. Bu hücreler daha sonra bu prosedüre başlamak için daha sonra gösterilecek olan genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılabilir. Bir maya yıldızı kiti ile çeşitli zaman noktalarında toplanan hücrelerden saflaştırılmış genomik DNA.

Üreticinin talimatlarına göre bir modifikasyon ile, 300 mikrolitre 0.1 XTE içeren DNA. Ardından, her numune için iki PCR reaksiyonu ayarlayın. Biri UPT etiketleri, diğeri aşağı etiketler için.

Elde edilen PCR ürünlerini bir jel üzerinde kontrol edin. Birinci ve üçüncü şeritlerde gösterildiği gibi hibridizasyon için kullanılan amplikonlar için her iki PCR için 60 baz çifti ürünü beklenmektedir. Bu örnekte, beşinci ve yedinci şeritlerde gösterildiği gibi barkod dizilimi için amplikler için 130 baz çifti çarpımı beklenmektedir.

Bu noktada, PCR ürünleri, hangi PCR ürününün oluşturulduğuna bağlı olarak mikroarray analizi veya doğrudan barkod dizilimi için kullanılabilir. Mikrodizi analizine hazırlanmak için, hibridizasyon fırını sıcaklığını 42 santigrat dereceye ısıtın ve bir kaynar su banyosu ve buzlu su bulamacı içeren bir buz kovası kurun. 120 mikrolitre one x hibridizasyon ile yavaşça doldurarak dizileri önceden ıslatın. Arabellek.

Diziler inkübe edilirken hibridizasyon tamponundaki dizileri 42 santigrat derece ve 20 RPM'de 10 dakika inkübe edin, 120 mikrolitre hibridizasyon ile kilit üstü 0,5 mililitrelik tüpler hazırlayın. Numune başına ve her tüpe tampon olarak bir tane daha karıştırın. Toplam 150 mikrolitre hacim için hibridizasyon karışımına 30 mikrolitre alım, PCR ve 30 mikrolitre aşağı etiket PCR ekleyin.

İki dakika kaynatın ve en az iki dakika buzlu suda bekletin. Kullanmadan önce tüpleri kısaca döndürün. Ön hibridizasyon tamponunu dizilerden çıkarın ve buharlaşmayı önlemek için 120 mikrolitre hibridizasyon PCR karışımı ekleyin.

Dizi contalarını sert bir nokta ile örtün, 42 santigrat derece ve 20 RPM'de 16 saat boyunca hibridleyin. Dizileri hibridizasyon fırınından çıkarın ve talaşlardaki sert noktaları çıkarın. Hibridizasyon karışımını pipet ile dizilerden yavaşça çıkarın ve dizileri doldurun.

120 mikrolitre yıkama ile dizileri astarlanmış akışkan istasyonunun yıkayıcısına yükleyin. Diziler, aşağıdaki modifikasyonlarla Flex SV 3 4 50 protokolü gen kullanılarak yıkanacaktır. Boyamadan önce yıkama A ile bir ekstra adım.

B'yi yıkayın, 40 santigrat derece yerine 42 santigrat derece sıcaklık ve akışkan istasyonda 25 santigrat derece yerine 42 santigrat derecede boyama. Akışkan işlemlerini takiben, akışkan istasyonunu çalıştırın, dört 50 protokolünü kapatın. Hava kabarcığı olmadığından emin olduktan sonra yıkayıcıyı boşaltın.

Dizileri tarayıcıya yerleştirin ve 560 nanometre emisyon dalga boyunda tarayın. 130 baz çifti PCR ürünü, %12 sayfalık bir jel üzerinde bu ilk ayrı 12 havuz DNA örneğini gerçekleştirmek için yeni nesil barkod dizilimi için kullanılır. Ardından, jeli siber yeşil ile boyayın ve ilgilenilen jel bandını kesin.

Jelden ekstrakte edilen DNA daha sonra gerçek zamanlı PCR ile ölçülür ve CBOT ve tek okuma kümesi oluşturma kiti kullanılarak tek bir okuma akış hücresi üzerinde kümeler oluşturulur. Akış hücresini sıralayıcıya yükleyin ve ilk tabanın çıktığını gözlemleyin. Burada gösterilen sıralayıcı, protokolün belirli noktalarında toplanan temsili dizi verileridir.

Etiketli etiketli mutantların havuzu, antifungal ajan klotrimazolün varlığında 20 nesil boyunca büyütüldü ve bir kontrol günlüğü olarak DMSO'da her gen için iki oran hesaplandı ve çizildi. Klotrimazol tedavisine önemli ölçüde duyarlı olan tüm bu suşlar, iki log iki oranı ile kırmızı ile vurgulanmıştır. Bu örnekte dört suş gösterilmiştir, NCP bir ERG iki ve ERG 11'in iki bağımsız aleli.

Havuzlanmış bir ekranda hassas olarak tespit edilen antifungal ilaç klotrimazol suşlarının bilinen protein hedefi, aynı konsantrasyonda ilacın varlığında bireysel büyüme deneylerindeki duyarlılıkları açısından doğrulanmalıdır. Bu sonraki grafik, buradaki bir doğrulama deneyinin sonuçlarını göstermektedir. Ekranda tespit edilen dört suş, vahşi tip ana suşa göre büyümeyi azalttı.

BWP 17 siyah renkle gösterilir. Bu bireysel büyüme eğrileri, bu tür havuzlanmış gen ilaç ekranlarının önemli bir özelliğini vurgulamaktadır, bu da belirli bir suşun mutlak sıralamasının, tam duyarlılık seviyesini mutlaka yansıtmamasıdır. Ayrıca, sonuçlar her gen için birden fazla alele sahip olmanın değerini göstermektedir.

Bu durumda, iki ERG 11 bozulma mutantının ilaca karşı biraz farklı hassasiyetleri vardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, ekranın aşılanmasından düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse verilerin analiz edilmesine kadar beş gün içinde yapılabilir. Bu nedenle, her bir deney biyolojik olarak açıklayıcı olsa da, gerçek güç, çok sayıda deney yaptığınızda ve artık gen fonksiyonunu ve ilaç etkisini tahmin edebilecek şekilde bir veri tabanı topladığınızda ortaya çıkar.

Bu videoyu izledikten sonra, havuz taraması için genom çapında barkodlu mutant koleksiyonlarının nasıl hazırlanacağını ve ayrıca geliştirildikten sonra ilgilenilen genleri tanımlamak için mikroray veya dizilemenin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, fonksiyonel genomik alanındaki araştırmacıların, maya genomundaki 6.000 farklı genin her birinin işlevini keşfetmelerine izin verdi.