Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, nörodejenerasyon modellerindeki hücre içi olayları incelemek için tekil drosophila veya matia'yı diseke etmek ve görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle sinek başının gövdenin geri kalanından ayrılması ve ardından kesilerek açılmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından, beyin ve diğer dokular kafanın içinden çıkarılır. Daha sonra kütikül uzaklaştırılır ve her bir retina ikiye bölünür. Prosedürün son adımı, tungsten bir iğne ile O'yu oyup çıkarmak ve bunları bir lama yerleştirmektir.

Sonuç olarak, floresan konfokal mikroskopi aracılığıyla sitoplazmik otofajik organelleri gösteren bulgular elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, şimdiye kadar bu alanda yalnızca genetik içgörüler sunabilen nörodejenerasyon drosophila modellerinde yüksek çözünürlüklü hücre biyolojik analizine olanak tanıması ve prosedürün değişkenlik göstereceğini kanıtlamasıdır. Laboratuvarımdan bir lisansüstü öğrenci, merkezdeki bir histoloji ve mikroskopi teknisyeni olan Daniel Mackay'in yardımıyla çalışmayı gerçekleştirmiştir.

Başlamak için, üç kuyucuklu bir cam lamın bir kuyucuğunu fosfat tamponlu salin ile doldurun, ardından sinekleri karbondioksit ile anesteziye alın. Sinekler anesteziye alındıktan sonra, bir pens yardımıyla tek bir sineği seçin ve PBS içeren küçük kabın içine bırakın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, probosisi pensle sıkıştırın ve ardından boyun kısmını keserek kafayı gövdeden ayırın.

Sinek başını probosis kısmından tutan ikinci bir pens kullanarak, başı mikro makasla lateral rostral orta hat boyunca ikiye bölün. Beyni açığa çıkarmak için, kesilmiş bir pipet ucuyla başı kaldırıp retinayı tutturun ve Schneider medium ile dolu başka bir kuyuya aktarın. Baş kütikülünün büyük kısmını pensle soyun ve ardından beyni çıkarın.

Retinayı lamina ve kornea arasında sıkıştırılmış halde tutun. Ardından, retinayı 50 µL taze Schneider ortamı damlasına aktarın. Doğrudan bir lam üzerine yerleştirilmiş olan retinanın en dorsal veya ventral ucunu, mikro makas kullanarak forsepsle kavrayın.

Gözün ortasındaki AMIA'yı açığa çıkarmak için retinayı dorsal ventral orta hattı boyunca ikiye kesin. Kornea aşağıya, lamina ise yukarıya bakacak şekilde retinayı tutmaya devam edin. İnce bir tungsten iğne kullanarak, önce oia'yı laminadan, ardından korneadan ayırın.

Tekil oia'lar ve OIA grupları kuyucuğun veya lamın tabanında toplanacaktır. Devam etmeden önce toplanmış olabilecek daha büyük kalıntıları temizleyin. Otofajiyi analiz etmek için, LysoTracker'ı bir damla Schneider ortamında 1:1000 oranında seyreltin, karıştırın ve 10 saniye bekleyin.

Slayttaki fazla sıvıyı uzaklaştırın. AMIA'nın orada kaldığından emin olun. AMIA'yı kaplamak için bir damla vector shield ekleyin.

Konfokal mikroskopi kullanarak bir kapatma camı yerleştirin ve oje ile sızdırmaz hale getirin; hem GFP-ATG8 ile işaretlenmiş otofagozomlar hem de LysoTracker ile işaretlenmiş lizozomlar, atropin mutant formu eksprese eden bir sinekten diseke edilmiş tek bir tediumda görselleştirilebilir. Sağ üstteki brightfield paneli, tediumun neredeyse bozulmamış yapısını göstermekte olup çerçeve taranan alanı belirtmektedir. Burada kırmızı lizozomları, yeşil ise otofagozomu işaretlemektedir.

İki organelin kaynaşması sonucu oluşan oto-lizozomlar sarı renkli görünür. Bu prosedürlerin ardından, farklı genetik yapılara sahip nöronal hücrelerdeki otofaji belirteçleri üzerindeki etkili bileşikler gibi farklı soruları yanıtlamak için materyal kültürü ve ilaç uygulaması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Drosophila genetiğinin avantajlarını, hücre kültüründe mümkün olan bazı gelişmiş hücre biyolojik analizlerle birleştirmek.