Name: Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Keşfedin oral skuamöz hücre karsinomu fare modelinde çok foton mikroskopi ile tümör hücre istilasının üç boyutlu görüntülenmesi ve kantitatif analizi. Bu yöntem, anti-invaziv tedavi stratejilerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH hibe P20 RR16440 bir alt ve bir köprü hibe West Virginia Üniversitesi Araştırma ve Lisansüstü Eğitimi Office S. Weed tarafından desteklenir. Proje geliştirme erken aşamalarında L. Lopez-Skinner Teknik yardım minnetle kabul edilmektedir. Yazarlar ayrıca teknik yardım ve J. Myers ve M. Younes (Baş ve Boyun Cerrahisi Anabilim Dalı, MD Anderson Kanser Merkezi, Houston, Teksas) OSC19 hücreleri için minnettar P. Turner ve K. Secrest (West Virginia Üniversitesi; histolojik işlem ve prosedürler için Patoloji Doku Bankası), R. Wysolmerski pLL7.0 lentiviral vektör LifeAct mCherry inşa ve J. Bear (Kuzey Carolina Üniversitesi) (West Virginia Üniversitesi, Nörobiyoloji ve Anatomi Anabilim Dalı). West Virginia Üniversitesi Mikroskopi Görüntüleme Tesisi (NIH hibe P20 RR16440 ve Mary Babb Randolph Kanser Merkezi tarafından desteklenen) kullanımı ve non-lineer optik mikroskop laboratuarı (NLOM, West Virginia Üniversitesi Nörobilim Merkezi arasında işbirliği ve ortak bir tarafından desteklenen Fizik / West Virginia Nanobilim Girişimi Batı Virginia Üniversitesi) da şükranlarımızı sunarız. NLOM Nörobilim Merkezi NIH hibe P30 RR031155 kısmen desteklenmektedir.

1. Hücre Hatları, Vektör İnşaat ve lentiviral Üretim <ol><li> İnsan baş ve boyun tümör hücreleri hatları (OSC19 veya UMSCC1)% 10 fetal sığır serumu FBS (Hyclone kedi # SH30070.03),% 1 penisilin ile desteklenebilir (Cellgro kedi # 50-003-PB) DMEM oluşan eksiksiz bir medya kültüre edildi / streptomisin (Cellgro kedi # 30-002-CI), ve% 1 non-esansiyel amino asitleri (Cellgro kedi # 25-025-CI). </li><li> PLL7.0 lentiviral vektör LifeAct-mCherry kodlama sırası aktarmak için, ebeveyn mCherry cDNA Sbf1 tanıma site site mutagenez (Stratagene kedi # 200.518-5) kullanarak tanıma dizisi içine üç sessiz mutasyonlar getirerek değişmiş oldu. Sonra çıkan değiştirilmiş LifeAct mCherry dizisi PCR EcoR1/Sbf1 siteleri yanındaki ile amplifiye ve pLL7.0 LifeAct mCherry bir yapı oluşturmak için pLL7.0 içine subcloned. </li></ol> 2. pLL7.0-LifeAct mCherry Virüs Üretim <ol><li> Viral üretim lentiviral İfade Sistemleri manuel (Sistem Bioscience sürümü 2-051.018) göre yapılmıştır. </li><li> Ambalaj hücre hattı 293T/17 hücreleri (ATCC kedi # CRL-11268)% 40, HNSCC hatları için kullanılan aynı eksiksiz bir medya izdiham büyüdü. </li><li> Hücreler, sırasıyla (Clontech kedi # 631.312) CalPhos kullanarak pLL7.0 LifeAct-mCherry, psPAX2, 03:02:01 oranı pVSV-G vektörleri ile transfekte. </li><li> 24 saat sonra, transfeksiyon ilk medya taze medya ile değiştirildi. </li><li> Medya daha sonra toplanan ve doldurulan her 12 saat 72 saat boyunca ve 4 ° C'de saklanan </li></ol> 3. Kararlı LifeAct mCherry İfade Baş ve Boyun Hücre Hatları Üretim <ol><li> Toplanan medya 4 10 dakika 2000 rpm'de spun ° C </li><li> Bir ml virüs içeren açıklık medya doğrudan 12 saat OSC19 veya UMSCC1 hücreleri eklendi. Hücreler daha sonra durulanır ve bir virüs ek bir ml, başka bir 12 saatlik süre eklendi. </li><li> Hücreler dirençli koloniler seçmek için iki hafta boyunca 200mg/ml puromycin içeren medya ile tedavi edildi. </li><li> Surviving klonlar LifeAct-mCherry ifade floresan mikroskobu ile görsel olarak tarandı. Bireysel pozitif koloniler steril 3mm klonlama diskler (Fisher kedi # 0790710A) kullanarak typsinized. </li><li> Pozitif hücreleri geri dondurulmuş veya ortotopik enjeksiyon için kullanılan kadar 200mg/ml puromycin içeren medya tutuldu. </li></ol> 4. Ortotopik Tümör Xenograftlarında Oluşumu <ol><li> Bütün hayvan prosedürleri, West Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan (09-0821) ile bir protokol uyarınca yapılmıştır. </li><li> LifeAct mCherry ifade tümör hücrelerinin, tripsinize santrifüj ve 2.5 x 10 4 hücreler 50 mcL eksiksiz bir medya yeniden süspanse idi. </li><li> Tümör hücreleri, 27 bağlı bir ml şırınga ½ iğne içine yüklenmiştir. </li><li> Bayan atimik Fox1 nu / nu fareler yaşı 8 hafta (Harlan Laboratuvarlar), 80mg/kg ketamin ve 10mg/kg ksilizin kombinasyonu ile anesteziye edildi . Anestezi fareler bir ısıtma yastığı 37-40 ° C arasında muhafaza edildi. </li><li> Steril forseps kullanarak, dil ucu hafifçe kavradı ve oral kavite dikkatlice dışarı çıkardı. </li><li> Hücreler yavaş yavaş dilli arterler kaçınarak, dil merkezinde soğanlı bir kitle oluşturmak için her dilin bir yan içine enjekte edildi. </li><li> Fareler 2.1mg/kg yohimbin ile enjekte edilen ve anestezi kurtarma sırasında 2-3 saat takip edildi ısıtma yastığı için iade edildi. </li><li> Canlandırıldı sonra, fareler, yumuşak bir transgenik hamur diyet (Bioserve kedi # S3472) içeren steril kafeslere yerleştirilmiştir. </li><li> Fare 2-3 günde tartılır ve tümör başlangıcı için görsel olarak monitörize edildi. </li></ol> 5. Ex-vivo Görüntüleme Mouse Dilleri hazırlanması <ol><li> Farklı zaman noktalarında (enjeksiyon sonrası genellikle 2-4 hafta) tümörler barındıran Fare karbondioksit Solunduğunda ötenazi uygulandı. </li><li> Dilleri, ayıklanan 1X PBS ile durulanır ve monofilaman dikiş ipliği, yerel bir hobi dükkan ve bir boyutu 8 dikiş iğnesi kullanarak geleneksel bir parafin doku gömme kaseti bir tarafında (StatLab Cat # H104) bağlıydık. </li><li> Dilleri immobilize sonra, tüm kaset montaj 30mm doku kültürü çanak yerleştirilir ve 1X PBS dalmış. </li><li> İşlenmiş dilleri hemen iki foton uyarma mikroskopi için kullanılmıştır. </li></ol> 6. İki foton Mikroskopi Dil Tümörleri görüntüleme <ol><li> Dil kasetleri, dik bir mikroskobu (Sutter Aletleri Hareketli Mikroskobu (MOM)) amacı altında konumlandırılmış bir geri çekilebilir manivela kolu (Oda Servisi, Siskiyou enstrümanlar) özel olarak tasarlanmış bir tutucu güvenli 1X PBS içeren bir 60mm çanak batmış. </li><li> 40X/0.8NA suya daldırma objektif lens görünür tum on veya üzerinde doğrudan yerleştirildiveya lezyonlar. Safir lazer yoğunluğu 60 mW ve 755 nm dalga boyu giriş mCherry sinyali optimize etmek için (Mira, Tutarlı): Dilleri Ti ile iki foton mikroskobu ile görüntülenmiş. </li><li> Seri 1mm lazer tarama görüntüleri, toplam 15 ve 100 mikron (tümör hacmine göre) arasında bir doku derinliği üzerinde 1 mikron artan derinliklerde toplanmıştır. Görüntüler ScanImage, Karel Svoboda laboratuvar (Janelia Çiftlikleri, HHMI) tarafından geliştirilen MATLAB platformu dayalı bir açık kaynak programı kullanarak ele geçirildi. ScanImage raster tarama desen x / y galvanometric tarama aynaları kontrol etmek için iki kanallı bir çıkış oluşturur ve aynı zamanda bir veri toplama kartı (PCI-6610S ile photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) aynı anda maksimum dört-kanallı sinyal girişi yakalar National Instruments). PMT sinyalleri monitör ekranında görüntülemek için NI-DAQ kurulu besleyen önce düşük gürültü akımı preamplisi (SR570, Stanford Araştırma Sistemi) tarafından güçlendirilir. ScanImage amacı z-ekseni kontrol z yığın görüntüleri toplar ve tek bir ya da çevrim modunda zaman atlamalı görüntüleri toplar. Görüntüler tek bir TIFF dosyası 16 bit derinliği kaydedildi. </li></ol> 7. Amira Yazılımı kullanarak Görüntü Analizi <ol><li> Tümör ölçümü için Amira görüntüleme: Aimra yazılım, z-yığın görüntü kümesini içeren bir TIFF dosyası açın. </li><li> Dosya adını vurgulayın ve üç boyutlu render oluşturmak için Voltex işlevi uygulamak. Toplu işgal hücrelerin birkaç küçük, ayrışmış invaziv gruplar (IG) ile büyük bir primer tümörün görüntü işlenen görüntü tipik olarak görülür (Şekil 6A). </li><li> Primer tümörün kitle seçmek için, sonra, "Etiket Alan" Etiketleme "," Open Data "seçeneğini seçin. </li><li> Birincil Eşikleme tüm z-yığın fotoğraf tümör seçin ve üç boyutlu içinde sadece primer tümörün kitle dahil sağlamak için z-düzlemi görüntüleri kaydırmak. Bu genellikle alanında büyük boyutlu görüntü ve sık sık, görüntülü z-düzlemi ile geçiş olarak bölümlenmiş görünür. </li><li> Eşiğe doğru ve görüntü atarak herhangi bir tümör sinyal vermeden bunu ortadan kaldırmak için sihirli değnek / eşik fonksiyonu kullanın. "Inside Dosya" etiketi vurgulayın ve ⊕ düğmesini tıklatın. "Tüm Dilimler" onay kutusunu seçin. Bu her z yığın artış eşiklenir primer tümör alanı çevresinde renkli bir sınır oluşturur. </li><li> ÇK seçmek için, "Yeni" fonksiyonunu seçin. Bir tek IG seçin ve z-düzlemi kaydırma primer tümör ile ilişkili değildir sağlamak. </li><li> "Tüm Dilimler" seçin ve ⊕ düğmesini tıklatın. Dosya (IG 1 ex) yeniden adlandırın </li><li> 7.4 eşikleme prosedürü tekrarlayın ve belirlenen IG 7.5 vurgulayarak adım. Primer tümörün kitle belirtmek için kullanılan renk farklı bir anahat rengini seçin. </li><li> Z-düzlemi ile tüm ÇK belirtilir sağlamak için tarama, görüntü boyunca her ek IG için gerekli tekrarlayın. Resmin üzerine gelecek tanımlama, her bir tespit IG yardımcıları için farklı renkler kullanma. </li><li> Primer tümörün ve tüm ÇK seçilir sonra, açılan menüden "Segmentasyon" seçeneğini seçin, daha sonra "Malzeme İstatistikleri" seçeneğini seçin. Bu hacim ölçümü yanı sıra, X, Y ve X tümör çekirdek merkezi tümör noktadan ÇK mesafeler hesaplamak için primer tümörün koordinatları sağlar. </li><li> Hacimleri hesaplandı, primer tümörün merkezi bir çekirdek, her IG mesafeyi belirlemek. Sonra "Segmentasyon", "Malzeme İstatistikleri" seçin. Bu adım, tüm ölçümler piksel içine hesaplar. Mikroskop objektif kalibrasyon ve büyütme (zoom fonksiyonları gibi) herhangi bir ek artış dayalı mikrometre piksel dönüştürün. Bu deneylerde kullanılan mikroskop ve ayarları için, 1 piksel = 0,298 mm 40X objektif bir kalibrasyon vererek, herhangi bir zoom ile kullanılmıştır. Primer tümörün üç boyutlu (X1, Y1, Z1) ve her IG (X2, Y2, ilk IG Z2 eski) parametreleri veren bir Excel elektronik tablo, veri alma. </li><li> Primer tümörün merkezinde her IG mikron işgal mesafe, formül √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) 2 + (Z2-Z1) 2) kullanılarak hesaplanır . </li><li> Tümör invaziv indeksi (T) T I = N T x V T x D T, N T = görüntü ÇK toplam sayısı, V T = tüm ÇK toplam hacmi, D T formülü kullanılarak hesaplanır. = toplam mesafe, primer tümörün merkezi tüm invaziv grupların gitti. </li></ol> 8. Nikon NIS-Elements Yazılım Üç boyutlu render <ol><li> Üç boyutlu render Nikon NIS-Elements yazılımı içine tümörün tamamını görüntü siyah-beyaz orijinal 16-bit TIFF dosyaları ithal ederek, daha fazla topografik ayrıntı elde edilebilirpaketi (Nikon, Melville, NY). "File" seçeneğini seçin, ardından "ND", sonra "Dosya Sıra ND Dosya oluşturma". TIFF z serisi görüntü yığını seçin ve uygun adım boyutu belirtin. </li><li> Xy düzleminde ND belge Kalibre. Manuel kalibrasyon kullanarak bir piksel boyutunu belirtin. </li><li> "Volume View" seçin. "HQ" fonksiyonu, yüksek kalite için z-düzleminde ek dilimler hesaplamak için kullanın. "3D Renderer Ayarlar" "Gelişmiş Renderer", "Ultra Yüksek Detayları" ve "Tam Çözüm" kalitede kullanın. Tümör yüzeyler vurgulamak için "Alpha Blending" seçin. </li><li> Sunum için üç boyutlu görüntü optimize edin. Tümör ve ilişkili ÇK ve gerektiği gibi bitki Zoom. Xyz uçakları görüntü döndürün ve LUT ayarlayabilirsiniz. </li><li> Sunum için görüntü yakalayın. "Düzen-Görünüm Oluştur Snapshot (8 bit RGB)" seçeneğini seçin. Adı ve buna göre dosyayı kaydedin. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1. Genel şematik ortotopik dil tümör üretimi ve in situ iki foton görüntüleme önemli adımlar gösteren. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2 fare dillerine OSC19 hücreleri ifade LifeAct-mCherry Enjeksiyon. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Şekil 3"> Şekil 3 Rezeke tümör içeren fare dil iki foton görüntüleme için hazırlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Şekil 4"> Şekil 4 içeren bir tümör görüntüleme için hazır bir iki foton mikroskopi pozisyon dil Oryantasyon. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Şekil 5"> Şekil 5 ScanImage gösteren ilk iki foton görüntü ham veri toplama vuruldu Temsilcisi ekran. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Şekil 6"> Şekil 6 ortotopik OSC19 tümörü Görüntü analizi ve tümör invazyonu ölçümü. Amira Voltex render (A) ve tek bir eşiklenir z-bölüm Temsilcisi ekran görüntüsü görüntüleri (B) birincil primer tümör ile özetlenen, mavi özetlenen, mor, invaziv grup 1 (IG-1), IG-2 kırmızı ve IG özetlenen -3 yeşil tanımlama prosedürü bir örnek olarak sıraladı. Arrowheads ÇK ifade eden (A) ve (B) C. hacim Arsalar karşı tümör invazyonu indeksi (Ti) hesaplamak için kullanılan sekiz ayrı ÇK için mesafe işgal etti. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Şekil 7"> Şekil 7 Temsilcisi tümörlerin görüntüleri ve görüntüleri, geleneksel bir IHC yaklaşım ile karşılaştırıldığında bu protokolü tümör grupları işgal etti. UMSCC1 ortotopik tümör barındıran bütün bir fare dil A. Parafin bölümü . Immünohistokimyasal boyama HNSCC özel hücre işaretleyici emmprin (Zymed; kedi # 34-5600) karşı primer antikor ile geleneksel prosedürleri kullanarak yapılmıştır 1:1000 dilüsyon ve OmniMap DAB anti-Rb algılama kiti (Ventana kedi # 760 kullanılarak görüntülendi -149) tarafından demir hematoksilen boyama izledi. Görüntüler toplam dil alanı kapsayan bir Optronics MicroFire CCD kamera ile bir Olympus ZX70 Provis mikroskop 4X büyütme tek tek toplanır ve StereoINvestigator görüntüleme paketi (Bioscience MBF) kullanılarak yeniden inşa edildi. Tümör dil ucunda açıktır. Invaziv ön ve bireysel tümör hücre grupları (ok) gösteren genişlemiş bir bölge temsilcisi OSC19 bir tümör (B) C. Nikon NIS-Elements render gösterilmiştir. Gelişmiş kontur detay ve ÇK açık görselleştirme (ok başları) açıktır. Tüm görüntüleri bar = 100 mm.

<ol><li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Oncol%22%5BJournal%5D)">Xenograft models of head and neck cancers.</a> Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).</li>
<li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cancer+in+the+head+and+neck+region%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cancer in the head and neck region.</a> Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).</li>
<li>Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+nude+mouse+model+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma.</a> Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).</li>
<li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).</li>
<li>Sano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+combination+anti-endothelial+growth+factor+receptor+and+anti-vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+targeted+therapy+on+lymph+node+metastasis%3A+a+study+in+an+orthotopic+nude+mouse+model+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).</li>
<li>Kupferman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+induces+EMT+and+has+a+key+role+in+invasion+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).</li>
<li>Ammer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+Impairs+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+by+Disrupting+Invadopodia+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Sci+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function.</a> J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+labeled+anti-epidermal+growth+factor+receptor+antibody+to+image+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts.</a> Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).</li>
<li>Gleysteen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeled+anti-EGFR+antibody+for+identification+of+regional+and+distant+metastasis+in+a+preclinical+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model.</a> Head Neck. 30, 782-789 (2008).</li>
<li>Bhirde, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+killing+of+cancer+cells+in+vivo+and+in+vitro+with+EGF-directed+carbon+nanotube-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.</a> ACS Nano. 3, 307-316 (2009).</li>
</ol>

Ortotopik fare modelleri, baş ve boyun kanseri 1,2 birçok açıdan inceleyerek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır . Biz Scot 3 ortotopik sistemi iyi kurulmuş bir baş ve boyun tümör hücresi invazyonu erken olayları incelemek için bir sistem olarak mCherry etiketli hücreleri iki foton mikroskobu görüntüleme ile kombine var. Bu yöntemde, hücreler özellikle altı hafta ya da daha küçük, yetersiz dil boyutu nedeniyle farelerin tümör enjeksiyon sitesinden sızıntı olabilir kaydetti var. Biz bu sorunu önlemek için, yaşlı farelerin kullanın. Yaşlı farelerin büyük dil büyüklüğü, aynı zamanda dil lingual arter ve aşırı kanama rüptürü kaçınarak yardımcı olur. Tümörü almak, dil dramatik ilk enjeksiyon yerinde şişer büyük ölçüde geliştirilebilir. Bu şişlik azalır enjekte edilen sıvı olarak bir-iki saat içinde emilir. Tümör büyüme dil yüzeyinde küçük beyaz bir yumru olarak belirtilen enjekte hücre sayısı belirgin bir-iki hafta enjeksiyon görünür. Ayrıca burada sunulan çalışmalarda kullanılan 40X amacı, bireysel tümör hücreleri ayırt edemez ama ÇK HNSCC işgali tipik modu özetlemek invaziv hücre kümeleri olarak tanımlar olduğunu unutmayın. Bugüne kadar bu model kapsamlı 4-7 IHC veya bioluminescent yöntemleri kullanılarak izlenir servikal lenf nodu metastazı ile ölçülen etkinlik, belirli molekülleri rol Scot büyüme bir işgalinden birkaç anti-tümör ilaçların yanı sıra test etmek için kullanılır olmuştur. Tümörler, bütün tümörler invaziv çok hücreli kümeleri gibi yerinde görüntü iki foton mikroskopi uygulama sağlayan, bu sistem tezahür yakın dil yüzeyi (Şekil 7) kurdu. Prosedürü de hücresel çözünürlük ile tümör invazyonu görselleştirmek için de kullanılabilir. İki foton mikroskopi ortotopik 8,9 ve 8,10 modelleri xenograft baş ve boyun kanseri için deneysel tedaviler daha önce çalışmak için kullanılmıştır. Ancak, bu raporlar ve protokol arasında iki önemli fark vardır. İlk olarak, bu çalışmalarda hedef / muhtemelen dolaşımı için yeterli erişim, sadece tümör hücreleri algılama sınırlayıcı, baş ve boyun tümör hücreleri tanımlamak için ekstrasellüler etiketleri kullanmayın. İkinci olarak, birincil siteye yakın tümör hücrelerinin muhtemel özetlediği erken metastatik etkinliği deneysel bir parametre olarak değerlendirilmektedir olmadığını işgali. Bizim protokol fare dilleri tümör ilerlemesi esnasında herhangi bir noktada doğrudan tümör hücresi invazyonu ölçmek için yeteneği sağlar. Burada anlatılan yöntem disseke dillerini kullanarak prosedürü açıklar iken, biz henüz erken invazyon, lokal lenf nodu tutulumu ve uzak metastaz aynı anda izlemek, biyoparlaklık ile birlikte kullanmak için canlı farelerde görüntü tümör invazyonu için bu yöntemi uyum sürecinde aynı hayvan. In vivo görüntüleme için protokol değişiklikler yanı sıra pratik bir sistem olarak düzgün görüntüleme işlemi sırasında anestezi farelerde oral kavite sulamak için, görüntüleme sırasında fareler konumlandırma için uygun bir sahne tasarımı ve bakımı gerektirir. Optimize sonra, bu uyarlamalar potansiyel pro-invaziv moleküller ve yerel işgali ve daha uzun süreler boyunca hayvanların daha uzak metastatik tutulum test anti-invaziv bileşiklerin rolü çalışma imkanı sağlayacaktır.

oral skuamöz hücre karsinomu ortotopik fare modeli tümör hücre invasion multi-foton görüntüleme

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-bölgesel işgali baş ve boyun kanseri metastaz riski ile bağlantılı ve hasta yönetimi stratejilerinin tasarımı ve uygulanması konusunda zor bir meydan okuma sunuyor. Ağız kanseri Ortotopik fare modelleri, bu faktörlerin çalışma kolaylaştırmak için geliştirilmiştir etkisi işgali ve anti-tümör terapatikler değerlendirmek için model sistem olarak hizmet. Bu sistemlerde, oral kavite dokularında içinde dissemine tümör hücrelerinin görselleştirme genellikle geleneksel histoloji ya da in vivo bioluminescent yöntemleri ile yapılmıştır. Bu tekniklerin doğru üç boyutlu birincil sitesinden kaynaklanan erken tümör hücresi invazyonu görselleştirmek ve ölçmek için birincil dezavantajı doğasında yetersizlik. Burada dilli tümörün yayılması çok vektörel görselleştirme izin iki foton görüntüleme ile dil skuamöz hücreli karsinom (Scot) için kurulmuş bir model birleştiren bir protokol açıklar. OSC-19 baş ve boyun tümör hücre hattı, stabil bir şekilde mCherry floresan protein (LifeAct mCherry) erimiş F-aktin bağlayıcı peptid LifeAct ifade etmek için tasarlanmıştır. Bu hücreler enjekte Fox1 nu / nu fareler güvenilir dil iki foton mikroskopi ex-vivo uygulama tarafından görüntülendi izin tümörleri oluşturur. Bu teknik, tümör kitlesi ortotopik görünüm için ve yerel, bölgesel tümör mikroçevresinin aksamadan eksize dilleri hücreleri istila sağlar. Buna ek olarak, bu sistem birincil tümör hücreleri hareket işgal mesafeleri hesaplanarak tümör hücresi invazyonu miktarının sağlar. Genel olarak bu işlem için geliştirilmiş bir model sistem Scot işgali ve tedavi tedaviler, lokal invazyon ve uzak metastatik yayılmasını önlemek için özel katkıda bulunan faktörler analiz sağlar. Bu yöntem de, sonuçta bir in vivo ortamda diğer görüntüleme yöntemleri ile kombine edilebilir potansiyele sahiptir.

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Baş ve boyun kanserinin loko-rejyonal invazyonu, metastatik risk ile ilişkilidir ve hasta ... tasarlanması ve uygulanmasında zorlu bir sorun teşkil etmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, dildeki tümör invazyonunun görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine olanak tanıyan bir oral kanser fare modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle LifeAct-Mcherry'nin lentiviral enfeksiyonu ve stabil klonal seçilim yoluyla iki foton görüntüleme için oral skuamöz karsinom hücreleri üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, anestezi uygulanmış farelerin dillerine LifeAct-Mcherry ile işaretlenmiş hücrelerin enjekte edilmesiyle nude farelerde ortotopik ksenogreft tümörler oluşturulur.Ardından, tümör içeren diller iki foton mikroskopisi ile görüntülenir. Nihayetinde, taze dil dokusunun iki foton görüntülemesi ve primer tümörlerin ile bölgesel olarak invaze olmuş hücre gruplarının ardından bilgisayar destekli üç boyutlu rekonstrüksiyonu aracılığıyla, dil kası içindeki kantitatif lokal oral tümör invazyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin immünohistokimya veya biyolüminesans görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tümörlü hücre invazyonunun üç boyutlu olarak kantitatif şekilde ölçülebilmesidir.Bu tekniğin doğurguları, tümör invazyonunda rol oynayan proteinlerin analizi ve anti-invaziv terapötik stratejiler üzerine preklinik bileşiklerin değerlendirilmesi için bir model sistem sağladığından, oral kanserin terapötik müdahalesine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, tümör hücrelerinin dile enjeksiyonu ve dilin iki foton mikroskobisi için hazırlanması teknik açıdan zor olduğundan, beceri ve pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayacaklardır. Tümör enjeksiyonu ve iki foton adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve uzmanlık gerektirdiğinden, bu yöntemin görselleştirilmesi kritiktir. Kültüre başlamak için.%10 FBS, %1 penisilin streptomisin ve %1 temel olmayan amino asitlerle desteklenmiş DMEM'den oluşan tam besiyerinde insan baş ve boyun tümör hücre hatları. LIFE Act mCherry kaplama dizisini PLL 7.0 lentiviral vektörüne aktarmak için öncelikle ana mCherry cDNA'daki SBF1 tanıma bölgesine üç sessiz mutasyon yerleştirmek amacıyla bölgeye özgü mutajenez gereklidir. Ardından, yanlarda ECO R1 ve SBF1 bölgeleri bulunan modifiye Life Act mCherry dizisi PCR ile amplifiye edilir ve PLL 7.0'a subklonlanır. Lentiviral ekspresyon sistemini takiben bir PLL 7.0 LIFE Act mCherry konstrütü oluşturmak için, paketleme hücre hattı 293T tam besiyerinde %17 ila %40 konfluense kadar kültüre edilir.CalFoss kullanarak hücreleri sırasıyla 3:2:1 oranında PLL 7.0, LIFE Act M cherry, PS PACS 2 ve P-V-S-V-G vektörleri ile transfekte edin. 24 saat sonra ortamı taze, komple besiyeri ile değiştirin, toplanan besiyerini her 12 saatte bir 72 saat boyunca toplayıp yenileyin ve stabil LIFE Act M cherry ekspresyonuna sahip baş ve boyun hücre hatları üretmek için toplanan besiyerini 4 °C'de saklayın. Toplanan besiyerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 2000 RPM'de santrifüjleyin; virüs içeren berraklaştırılmış besiyerinden 1 mL'yi OSC 19 veya US CCC 1 hücrelerine ekleyerek 12 saat bekletin.Hücreleri durulayın, ardından 12 saatlik bir süre daha için ek olarak bir mililitre virüs ekleyin. Dirençli kolonileri seçmek için hücreleri, iki hafta boyunca mililitre başına 200 miligram purmycin içeren ortamda kültüre edin. Hayatta kalan kolonileri, floresan mikroskobu ile m cherry ekspresyonuna göre görsel olarak tarayın; pozitif kolonileri steril üç milimetrelik klonlama diskleri kullanarak tripsinize edin.Pozitif hücreleri, dondurulana kadar veya ortotopik tümör ksenogrefti oluşturmak için ortotopik enjeksiyonda kullanılana kadar 200 mg/mL purmycin içeren besiyerinde muhafaza edin. Ardından, M cherry eksprese eden tümör hücrelerini içeren kültürü santrifüjleyin ve yaklaşık 2,5 × 10⁴ hücreyi 50 µL komple besiyerinde yeniden süspande edin. Tümör hücrelerini, 27 gauge yarım inçlik iğne takılı 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.Ardından, sekiz haftalık dişi atimik çıplak fareyi, kilogram başına 80 miligram ketamin ve kilogram başına 10 miligram ksilazin kombinasyonu ile anestezi edin. Hayvan hareket etmeyi bıraktığında, göz yağlayıcı pomad uygulayın ve ayak tabanına tırnağınızla bastırarak yanıt verme durumunu kontrol edin.Fareleri 37 ile 40 santigrat derece arasındaki bir ısıtma pedinde tutun. Steril pens kullanarak, dilin ucunu nazikçe kavrayın ve ağız boşluğundan dışarı çekin. Dil merkezinde yumrulu bir kitle oluşturmak için hücreleri her bir dilin bir tarafına yavaşça enjekte edin.Farelere kilogram başına 2,1 miligram yohimbine enjekte edin ve anesteziden çıkış süreçlerini izlemek için onları tekrar ısıtma pedine yerleştirin. Fareleri, yumuşak transgenik hamur diyeti içeren steril kafeslere yerleştirin. Fareleri her iki ila üç günde bir tartın ve tümör başlangıcı açısından görsel olarak izleyin.Ex vivo görüntüleme için fare dillerini hazırlamak amacıyla, farklı zaman noktalarında tümör taşıyan fareleri ötanize edin. Karbondioksit inhalasyonu kullanarak dilleri çıkarın ve 1x PBS ile durulayın. Ardından, yerel bir hobi mağazasından temin edilen monofilaman dikiş ipi ve sekiz numara dikiş iğnesi kullanın.Dili, standart bir parafin doku gömme kasetinin bir tarafına sabitleyin. Dil immobilize edildikten sonra, kaset düzeneğinin tamamını 1X PBS içine daldırın. İki foton mikroskopisi ile görüntüleme yapmak için dilleri derhal işleme alın.Dil kasetlerini, içinde 1X PBS bulunan 60 milimetrelik bir kaba daldırın. Kabı, iki foton mikroskobunun objektifinin altına yerleştirilmiş geri çekilebilir bir konsol kol üzerindeki özel tasarım bir tutucuya sabitleyin. 40 x 0.8 nümerik açıklıklı su daldırma objektif lensini doğrudan görünür bir tümör lezyonunun üzerine veya üstüne yerleştirin.Dilin görüntülemesini, 60 milliwatts şiddette ve 755 nanometers giriş dalga boyunda titanyum safir lazer kullanılarak iki foton mikroskopi ile gerçekleştirin. M cherry sinyalini optimize etmek için, 15 ve 100 micrometers arasındaki toplam doku derinliği boyunca, birer micrometers artışlarla seri bir micrometers lazer tarama görüntüleri toplayın. Bu konfigürasyon ile doku derinliği bir millimeter'e kadar olan tümörler analiz edilebilir.Görüntüleri yakalamak için tarama görüntüsü özelliğini kullanın. Tarama görüntüsü, XY galvanometrik tarama aynalarını kontrol etmek için iki kanallı bir raster tarama deseni çıktısı üretirken, aynı zamanda bir veri toplama kartı aracılığıyla fotomültipliyer tüplerden maksimum dört kanallı bir sinyal girişini eş zamanlı olarak yakalar. Tarama görüntüsü, objektifin Z eksenini kontrol ederek Z yığını görüntüleri toplar ve tekli veya döngüsel modda zaman ayarlı görüntüler toplar.Görüntüleri 16 bit derinliğe sahip tek bir TIF dosyası olarak kaydedin. Z yığını görüntü setini içeren TIF dosyasını açarak, Amira yazılımını kullanarak tümör görüntü yığınlarını tek bir üç boyutlu görüntüye dönüştürün. Üç boyutlu bir görüntüleme oluşturmak için TEX fonksiyonunu kullanın.Oluşturulan görüntüde, muhtemelen birkaç küçük ayrık invaziv grup (ig) içeren büyük bir primer tümör görüntüsü yer alacaktır. Tümör hacmini ölçmek için, primer tümör alanının eşik değerini belirleyin ve görüntü yığınının her bir kesitinde arka plan floresansını düzeltip giderin. Eşikleme işlemini her bir invaziv grup için tekrarlayın.Primer tümör ve tüm ig'ler seçildikten sonra, primer tümör için hacim ölçümünün yanı sıra X, Y ve Z tümör OID koordinatlarını belirleyin. ig'lerin merkezi tümör noktasından olan uzaklıklarını hesaplamak için, ti = NT × VT × dt formülünü kullanarak tümör invaziv indeksini veya ti'yi hesaplayın. Burada NT, görüntüdeki toplam ig sayısını; VT, tüm ig'lerin toplam hacmini ve DT ise tüm invaziv grupların primer tümörün merkezinden katettiği toplam mesafeyi ifade eder.Orijinal 16 bit monokrom uç dosyaları yazılım içindeki Nikon NIS elements'e aktarılarak daha fazla topografik detay içeren üç boyutlu görseller oluşturulabilir. Bir görüntü yığınından ND dosyası oluşturun. Ardından, daha yüksek kaliteli görseller elde etmek için piksel boyutunu belirlemek amacıyla dokümanı manuel olarak kalibre edin.Z düzleminde ek kesitler ekleyin. Bu şekil, iki fotonlu görüntüleme NIS elements veya bir ayna aracılığıyla elde edilen ham verilere bir örnek göstermektedir. Bu şekilde gösterilen dil tümörlerinin ham verilerini yeniden yapılandırmak için yazılım kullanılabilir.Bu panel, Amira yazılımındaki TEX fonksiyonu kullanılarak yapılan üç boyutlu görüntülemenin bir örneğini göstermektedir. Burada, primer tümör merkezini veya oid'i ve primer tümörden ayrılan invaziv grupları belirlemek için görüntü yığınındaki tek bir iki foton kesitinin eşikleme işlemine tabi tutulmuş bir örneği yer almaktadır. Her eşiklenmiş kesit analiz edildikten sonra, Amira her bir invaziv grubun hacmini ve Centro'dan katettiği mesafeyi nicelendirir.Bu veriler grafiksel olarak gösterilebilir ve tümör hücresi invazyonunun tam seviyesi için sayısal değer elde etmek amacıyla kullanılabilir. Burada gösterilen primer bölgeye ait olanlar, tanımlanan protokol kullanılarak benzer bir tümörün üç boyutlu görüntüsü ile karşılaştırıldığında, geleneksel patolojik immünohistokimyasal boyama ile görselleştirilen tümörlerin temsili görüntüleridir. Dil ekstrüksiyonundan nihai 3D görüntülemeye kadar olan süreç kavrandıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir; bu prosedürü gerçekleştirirken, tümör hücrelerinin kaybına yol açmamak ve tümör alımını engellememek için iğnenin dili delmemesine dikkat edilmelidir. Bu prosedürü takiben, oral kanser invazyonu üzerindeki etkinliklerini belirlemek amacıyla terapötik bileşiklerin veya manipüle edilmiş protein seviyelerine sahip hücrelerin testleri yürütülebilir.In vivo bir ortamda, lentivirüs ile modifiye edilmiş insan tümör hücreleriyle çalışmanın tehlikeli olduğunu unutmayın; enjekte edilen farelerle çalışırken uygun KKE kullanımı ve BSL 2 sertifikalı bir laminar akışlı kabinde çalışma gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model In vivo</emTümör Bağışıklık Yanıtları> Tümör Görüntüleme ve İzleme

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Bu videoda, skuamöz hücreli karsinom hücre hattının intramukozal inokülasyonu ile ortotopik bir baş ve boyun kanseri murin modeli geliştiriyoruz. Tümör taşıyan fare, insan hastalığının klinik olarak ilgili semptomlarına benzerlik gösterir ve bu nedenle kanserin ilerlemesini incelemek ve yeni terapötik stratejiler keşfetmek için kullanılabilir.

Murin Modelinde Kanser Hücrelerinin İntramukozal Aşılanması: Ortotopik Bir Baş ve Boyun Kanserli Fare Modeli Oluşturma Prosedürü

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Biz, tümörün büyüme sırasında oynayan normal biyo-fiziksel kısıtlamalar tekrarıdır intravital iki foton mikroskopi için farelerde kortikal glioblastoma ortotopik bir model oluşturduk. Tümörün yukarıdaki kafatasını yerine bir kronik cam pencere, iki-foton mikroskobu ile zamanla tümörün ilerlemesinin takibini sağlar.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Ortotopik meme kanseri primer tümör modeli ve primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması açıklanan spontan metastaz oluşturmak için fare ömrünü uzatmak için. tümör büyümesi ve ilerlemesi izlenir ve lusiferaz floresan görüntüleme ile ölçülür.

Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Burada bir orthotopic fare modeli baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu geliştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem mevcut. Tümör nekroz, zavallı farklılaşma, nodal metastaz ve bağışıklık infiltrasyon gibi hastalığın klinik histopatolojik özellikler göstermektedir. Tümörü taşıyan fareler disfaji, çene deplasman ve kilo kaybı gibi klinik belirtiler geliştirmek.

Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre Tümörü bağışıklık profil oluşturma için fareler ve tedaviye yanıt değerlendirme intramucosal aşı

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Bu protokol, optik koherens tomografi kullanılarak murin koroidine melanomun implantasyonu ve değerlendirilmesini tanımlamaktadır.

Murin Koroidinde Melanomun İmplantasyonu ve Optik Koherens Tomografi ile Değerlendirilmesi

İntravital mikroskopi bulgularının translasyonu, dokuya sığ derinlik penetrasyonu ile karşı karşıyadır. Burada, intravital mikroskopi bulgularının klinik translasyonunu potansiyel olarak kolaylaştıran, doğrudan uzamsal korelasyon için intravital mikroskopi ve klinik olarak uygulanabilir görüntüleme modalitelerinin (örneğin, BT, MRI) birlikte kaydedilmesini sağlayan bir dorsal pencere odası fare modelini açıklıyoruz.

Translasyonel Kanser Araştırmalarında Kombine İntravital Mikroskopi ve Manyetik Rezonans Görüntüleme için Dorsal Deri Kıvrımlı Pencere Odası Tümör Fare Modeli

Ağız boşluğunda kurulan ağız skuamöz hücreli karsinom tümörlerinin cerrahi olarak rezeksiyon edilmesinin benzersiz bir yöntemi burada gösterilmiştir.

Oral Skuamöz Hücreli Karsinomun Farenin Preklinik Modelleri İçin Translasyonel Olarak İlgili Tümör Rezeksiyon Modeli

Keşfedin oral skuamöz hücre karsinomu fare modelinde çok foton mikroskopi ile tümör hücre istilasının üç boyutlu görüntülenmesi ve kantitatif analizi. Bu yöntem, anti-invaziv tedavi stratejilerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Daha fazla video keşfet