Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, dildeki tümör invazyonunun görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine olanak tanıyan bir oral kanser fare modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle LifeAct-Mcherry'nin lentiviral enfeksiyonu ve stabil klonal seçilim yoluyla iki foton görüntüleme için oral skuamöz karsinom hücreleri üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, anestezi uygulanmış farelerin dillerine LifeAct-Mcherry ile işaretlenmiş hücrelerin enjekte edilmesiyle nude farelerde ortotopik ksenogreft tümörler oluşturulur.

Ardından, tümör içeren diller iki foton mikroskopisi ile görüntülenir. Nihayetinde, taze dil dokusunun iki foton görüntülemesi ve primer tümörlerin ile bölgesel olarak invaze olmuş hücre gruplarının ardından bilgisayar destekli üç boyutlu rekonstrüksiyonu aracılığıyla, dil kası içindeki kantitatif lokal oral tümör invazyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin immünohistokimya veya biyolüminesans görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tümörlü hücre invazyonunun üç boyutlu olarak kantitatif şekilde ölçülebilmesidir.

Bu tekniğin doğurguları, tümör invazyonunda rol oynayan proteinlerin analizi ve anti-invaziv terapötik stratejiler üzerine preklinik bileşiklerin değerlendirilmesi için bir model sistem sağladığından, oral kanserin terapötik müdahalesine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, tümör hücrelerinin dile enjeksiyonu ve dilin iki foton mikroskobisi için hazırlanması teknik açıdan zor olduğundan, beceri ve pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayacaklardır. Tümör enjeksiyonu ve iki foton adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve uzmanlık gerektirdiğinden, bu yöntemin görselleştirilmesi kritiktir. Kültüre başlamak için.

%10 FBS, %1 penisilin streptomisin ve %1 temel olmayan amino asitlerle desteklenmiş DMEM'den oluşan tam besiyerinde insan baş ve boyun tümör hücre hatları. LIFE Act mCherry kaplama dizisini PLL 7.0 lentiviral vektörüne aktarmak için öncelikle ana mCherry cDNA'daki SBF1 tanıma bölgesine üç sessiz mutasyon yerleştirmek amacıyla bölgeye özgü mutajenez gereklidir. Ardından, yanlarda ECO R1 ve SBF1 bölgeleri bulunan modifiye Life Act mCherry dizisi PCR ile amplifiye edilir ve PLL 7.0'a subklonlanır. Lentiviral ekspresyon sistemini takiben bir PLL 7.0 LIFE Act mCherry konstrütü oluşturmak için, paketleme hücre hattı 293T tam besiyerinde %17 ila %40 konfluense kadar kültüre edilir.

CalFoss kullanarak hücreleri sırasıyla 3:2:1 oranında PLL 7.0, LIFE Act M cherry, PS PACS 2 ve P-V-S-V-G vektörleri ile transfekte edin. 24 saat sonra ortamı taze, komple besiyeri ile değiştirin, toplanan besiyerini her 12 saatte bir 72 saat boyunca toplayıp yenileyin ve stabil LIFE Act M cherry ekspresyonuna sahip baş ve boyun hücre hatları üretmek için toplanan besiyerini 4 °C'de saklayın. Toplanan besiyerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 2000 RPM'de santrifüjleyin; virüs içeren berraklaştırılmış besiyerinden 1 mL'yi OSC 19 veya US CCC 1 hücrelerine ekleyerek 12 saat bekletin.

Hücreleri durulayın, ardından 12 saatlik bir süre daha için ek olarak bir mililitre virüs ekleyin. Dirençli kolonileri seçmek için hücreleri, iki hafta boyunca mililitre başına 200 miligram purmycin içeren ortamda kültüre edin. Hayatta kalan kolonileri, floresan mikroskobu ile m cherry ekspresyonuna göre görsel olarak tarayın; pozitif kolonileri steril üç milimetrelik klonlama diskleri kullanarak tripsinize edin.

Pozitif hücreleri, dondurulana kadar veya ortotopik tümör ksenogrefti oluşturmak için ortotopik enjeksiyonda kullanılana kadar 200 mg/mL purmycin içeren besiyerinde muhafaza edin. Ardından, M cherry eksprese eden tümör hücrelerini içeren kültürü santrifüjleyin ve yaklaşık 2,5 × 10⁴ hücreyi 50 µL komple besiyerinde yeniden süspande edin. Tümör hücrelerini, 27 gauge yarım inçlik iğne takılı 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.

Ardından, sekiz haftalık dişi atimik çıplak fareyi, kilogram başına 80 miligram ketamin ve kilogram başına 10 miligram ksilazin kombinasyonu ile anestezi edin. Hayvan hareket etmeyi bıraktığında, göz yağlayıcı pomad uygulayın ve ayak tabanına tırnağınızla bastırarak yanıt verme durumunu kontrol edin.

Fareleri 37 ile 40 santigrat derece arasındaki bir ısıtma pedinde tutun. Steril pens kullanarak, dilin ucunu nazikçe kavrayın ve ağız boşluğundan dışarı çekin. Dil merkezinde yumrulu bir kitle oluşturmak için hücreleri her bir dilin bir tarafına yavaşça enjekte edin.

Farelere kilogram başına 2,1 miligram yohimbine enjekte edin ve anesteziden çıkış süreçlerini izlemek için onları tekrar ısıtma pedine yerleştirin. Fareleri, yumuşak transgenik hamur diyeti içeren steril kafeslere yerleştirin. Fareleri her iki ila üç günde bir tartın ve tümör başlangıcı açısından görsel olarak izleyin.

Ex vivo görüntüleme için fare dillerini hazırlamak amacıyla, farklı zaman noktalarında tümör taşıyan fareleri ötanize edin. Karbondioksit inhalasyonu kullanarak dilleri çıkarın ve 1x PBS ile durulayın. Ardından, yerel bir hobi mağazasından temin edilen monofilaman dikiş ipi ve sekiz numara dikiş iğnesi kullanın.

Dili, standart bir parafin doku gömme kasetinin bir tarafına sabitleyin. Dil immobilize edildikten sonra, kaset düzeneğinin tamamını 1X PBS içine daldırın. İki foton mikroskopisi ile görüntüleme yapmak için dilleri derhal işleme alın.

Dil kasetlerini, içinde 1X PBS bulunan 60 milimetrelik bir kaba daldırın. Kabı, iki foton mikroskobunun objektifinin altına yerleştirilmiş geri çekilebilir bir konsol kol üzerindeki özel tasarım bir tutucuya sabitleyin. 40 x 0.8 nümerik açıklıklı su daldırma objektif lensini doğrudan görünür bir tümör lezyonunun üzerine veya üstüne yerleştirin.

Dilin görüntülemesini, 60 milliwatts şiddette ve 755 nanometers giriş dalga boyunda titanyum safir lazer kullanılarak iki foton mikroskopi ile gerçekleştirin. M cherry sinyalini optimize etmek için, 15 ve 100 micrometers arasındaki toplam doku derinliği boyunca, birer micrometers artışlarla seri bir micrometers lazer tarama görüntüleri toplayın. Bu konfigürasyon ile doku derinliği bir millimeter'e kadar olan tümörler analiz edilebilir.

Görüntüleri yakalamak için tarama görüntüsü özelliğini kullanın. Tarama görüntüsü, XY galvanometrik tarama aynalarını kontrol etmek için iki kanallı bir raster tarama deseni çıktısı üretirken, aynı zamanda bir veri toplama kartı aracılığıyla fotomültipliyer tüplerden maksimum dört kanallı bir sinyal girişini eş zamanlı olarak yakalar. Tarama görüntüsü, objektifin Z eksenini kontrol ederek Z yığını görüntüleri toplar ve tekli veya döngüsel modda zaman ayarlı görüntüler toplar.

Görüntüleri 16 bit derinliğe sahip tek bir TIF dosyası olarak kaydedin. Z yığını görüntü setini içeren TIF dosyasını açarak, Amira yazılımını kullanarak tümör görüntü yığınlarını tek bir üç boyutlu görüntüye dönüştürün. Üç boyutlu bir görüntüleme oluşturmak için TEX fonksiyonunu kullanın.

Oluşturulan görüntüde, muhtemelen birkaç küçük ayrık invaziv grup (ig) içeren büyük bir primer tümör görüntüsü yer alacaktır. Tümör hacmini ölçmek için, primer tümör alanının eşik değerini belirleyin ve görüntü yığınının her bir kesitinde arka plan floresansını düzeltip giderin. Eşikleme işlemini her bir invaziv grup için tekrarlayın.

Primer tümör ve tüm ig'ler seçildikten sonra, primer tümör için hacim ölçümünün yanı sıra X, Y ve Z tümör OID koordinatlarını belirleyin. ig'lerin merkezi tümör noktasından olan uzaklıklarını hesaplamak için, ti = NT × VT × dt formülünü kullanarak tümör invaziv indeksini veya ti'yi hesaplayın. Burada NT, görüntüdeki toplam ig sayısını; VT, tüm ig'lerin toplam hacmini ve DT ise tüm invaziv grupların primer tümörün merkezinden katettiği toplam mesafeyi ifade eder.

Orijinal 16 bit monokrom uç dosyaları yazılım içindeki Nikon NIS elements'e aktarılarak daha fazla topografik detay içeren üç boyutlu görseller oluşturulabilir. Bir görüntü yığınından ND dosyası oluşturun. Ardından, daha yüksek kaliteli görseller elde etmek için piksel boyutunu belirlemek amacıyla dokümanı manuel olarak kalibre edin.

Z düzleminde ek kesitler ekleyin. Bu şekil, iki fotonlu görüntüleme NIS elements veya bir ayna aracılığıyla elde edilen ham verilere bir örnek göstermektedir. Bu şekilde gösterilen dil tümörlerinin ham verilerini yeniden yapılandırmak için yazılım kullanılabilir.

Bu panel, Amira yazılımındaki TEX fonksiyonu kullanılarak yapılan üç boyutlu görüntülemenin bir örneğini göstermektedir. Burada, primer tümör merkezini veya oid'i ve primer tümörden ayrılan invaziv grupları belirlemek için görüntü yığınındaki tek bir iki foton kesitinin eşikleme işlemine tabi tutulmuş bir örneği yer almaktadır. Her eşiklenmiş kesit analiz edildikten sonra, Amira her bir invaziv grubun hacmini ve Centro'dan katettiği mesafeyi nicelendirir.

Bu veriler grafiksel olarak gösterilebilir ve tümör hücresi invazyonunun tam seviyesi için sayısal değer elde etmek amacıyla kullanılabilir. Burada gösterilen primer bölgeye ait olanlar, tanımlanan protokol kullanılarak benzer bir tümörün üç boyutlu görüntüsü ile karşılaştırıldığında, geleneksel patolojik immünohistokimyasal boyama ile görselleştirilen tümörlerin temsili görüntüleridir. Dil ekstrüksiyonundan nihai 3D görüntülemeye kadar olan süreç kavrandıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir; bu prosedürü gerçekleştirirken, tümör hücrelerinin kaybına yol açmamak ve tümör alımını engellememek için iğnenin dili delmemesine dikkat edilmelidir. Bu prosedürü takiben, oral kanser invazyonu üzerindeki etkinliklerini belirlemek amacıyla terapötik bileşiklerin veya manipüle edilmiş protein seviyelerine sahip hücrelerin testleri yürütülebilir.

In vivo bir ortamda, lentivirüs ile modifiye edilmiş insan tümör hücreleriyle çalışmanın tehlikeli olduğunu unutmayın; enjekte edilen farelerle çalışırken uygun KKE kullanımı ve BSL 2 sertifikalı bir laminar akışlı kabinde çalışma gibi önlemler her zaman alınmalıdır.