Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Etiketli hücreleri çok foton mikroskobu ile dil içinde ağız kanseri ve tümör invazyonu niceliksel olarak izlenmesi bir fare modeli üreten yer alan tekniklerin kapsamlı bir bakış sunulmaktadır. Bu sistem, anti-invaziv bileşiklerin moleküler değerlendirme ve ilaç etkinliği için faydalı bir platform olarak hizmet verebilir.

Bu prosedürün genel amacı, dildeki tümör invazyonunun görselleştirilmesine ve niceliklerinin belirlenmesine izin veren bir ağız kanseri fare modeli üretmektir. Bu, ilk olarak iki foton görüntüleme için oral skuamöz karsinom hücrelerinin üretilmesiyle, Lentiviral yaşam enfeksiyonu Act M kirazı ve stabil klonal seçim ile gerçekleştirilir. Daha sonra, ortotopik ksenogreft tümörleri, anestezi uygulanmış farelerin dillerine life Act M kiraz işaretli hücrelerin enjeksiyonu ile çıplak farelerde üretilir.

Daha sonra tümör içeren diller iki foton mikroskobu ile görüntülenir. Sonuç olarak, taze dil dokusunun iki foton görüntülemesi ve ardından primer tümörlerin ve bölgesel olarak invaze edilmiş hücresel grupların bilgisayar destekli üç boyutlu rekonstrüksiyonu yoluyla dil kası içinde kantitatif lokal oral tümör invazyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin immünohistokimya veya biyolüminesan görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tümörlü hücre invazyonunun üç boyutta kantitatif olarak ölçülebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, tümör invazyonunda yer alan proteinlerin analizi ve ayrıca anti invaziv terapötik stratejiler üzerinde klinik öncesi bileşiklerin değerlendirilmesi için bir model sistem sağladığı için ağız kanserine terapötik müdahaleye kadar uzanır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bireyler, tümör hücrelerinin dile enjeksiyonu ve dilin iki fotomikroskopi için hazırlanması teknik olarak zorlu, beceri ve pratik gerektiren bir durumdur. Bu yöntemin görselleştirilmesi, iki foton adımında tümör enjeksiyonunun öğrenilmesi zor olduğundan ve kültüre başlamak için özel beceri gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir.

% 10 FBS,% 1 penisilin streptomisin ve% 1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş DMEM'den oluşan tam ortamda insan baş ve boyun tümör hücre hatları. LIFE Act M kiraz kaplama dizisini PLL 7.0 lentiviral vektör bölgesine aktarmak için, öncelikle SBF'ye üç sessiz mutasyon eklemek için mutajenez gereklidir: ebeveyn mCherry CD NA'da bir tanıma bölgesi. Daha sonra PCR, ECO R, bir SBF, bir bölge ve PLL 7.0'a alt clent ile Modifiye Life Act mCherry dizisini çoğaltır. Bir lentiviral ekspresyon sistemi kültürünü takiben bir PLL 7.0 LIFE Act M kiraz yapısı oluşturmak için, paketleme hücresi hattı 2 9 3 T 17 ila %40 oranında tam ortamda birleşir.

Cal Foss'u kullanarak, hücreleri PLL 7.0, LIFE, Act M, kiraz, PS, PACS iki ve P-V-S-V-G vektörleri ile sırasıyla üç ila iki ila bir oranında transfekte edin. 24 saat sonra, ortamı taze, tam ortamla değiştirin, ortamı 72 saat boyunca her 12 saatte bir toplayın ve yenileyin ve toplanan ortamı, kararlı ömürlü Act M kiraz ifadesine sahip baş ve boyun hücre hatları üretmek için dört santigrat derecede saklayın. Toplanan ortamı 2000 RPM'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca döndürün, virüsü içeren arıtılmış ortamın bir mililitresini 12 saat boyunca OSC 19 veya US CCC bir hücreye ekleyin.

Hücreleri durulayın, ardından 12 saatlik bir süre için bir mililitre daha virüs ekleyin. Hücreleri iki hafta boyunca mililitre başına 200 miligram saf misin içeren ortamda kültürleyin Dirençli kolonileri seçmek için, hayatta kalan kolonileri ömür boyu görsel olarak tarayın. Floresan mikroskobu tripsin gözleri ile m kiraz ekspresyonu, steril üç milimetre klonlama diskleri kullanılarak bireysel pozitif koloniler.

Pozitif hücreleri, dondurulana kadar mililitre saf misin başına 200 miligram içeren ortamda tutun veya ortotopik bir tümör ksenogreft tripsin ömrü oluşturmak için ortotopik enjeksiyon için kullanın. M kiraz eksprese eden tümör hücreleri daha sonra kültürü santrifüjleyin ve 50 mikrolitre tam ortamda yaklaşık 2.5 kez 10 ila dördüncü hücreyi yeniden süspanse edin. Tümör hücrelerini 27 gauge yarım inçlik bir iğneye bağlı bir mililitrelik şırıngaya yükleyin.

Sonraki anestezi, sekiz haftalık dişi athimik tilki. Bir kilogram ketamin başına 80 miligram ve kilogram başına 10 miligram ksilazin kombinasyonuna sahip bir çıplak fare. Hayvan hareket etmeyi bıraktığında, göz kayganlaştırıcı merhem sürün ve ayak pedine bir tırnağınızı bastırarak yanıt verip vermediğini kontrol edin.

Fareleri 37 ila 40 santigrat derece arasında bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Steril forseps kullanarak, dilin ucunu nazikçe kavrayın ve ağız boşluğundan dışarı çekin. Dil merkezinde soğanlı bir kütle oluşturmak için hücreleri her dilin bir tarafına yavaşça enjekte edin.

Farelere kilogram yohi başına 2.1 miligram enjekte edin ve anesteziden iyileşme sırasında onları izlemek için ısıtma yastığına geri koyun. Fareleri yumuşak bir transgenik hamur diyeti içeren steril kafeslere yerleştirin. Fareleri her iki ila üç günde bir tartın ve tümör başlangıcı için görsel olarak izleyin.

Fare dillerini ex vivo görüntülemeye hazırlamak için, farklı zaman noktalarında tümör barındıran farelere ötenazi yapın. Karbondioksit inhalasyonunu kullanarak, dilleri çıkarın ve bir XPBS ile durulayın. Daha sonra yerel bir hobi dükkanından monofilament dikiş ipliği ve sekiz numara dikiş iğnesi kullanarak.

Dili, geleneksel bir parafin doku gömme kasetinin bir tarafına takın. Dil hareketsiz hale geldiğinde, tüm kaset düzeneğini tek bir XPBS'ye daldırın. İki foton mikroskobu kullanarak dilleri görüntülemek için dilleri hemen iki foton mikroskobu kullanarak işleyin.

Dil kasetlerini bir XPBS içeren 60 milimetrelik bir tabağa daldırın. Çanağı, iki foton mikroskobunun hedefi altına yerleştirilmiş geri çekilebilir bir konsol kolu üzerindeki özel tasarım bir tutucuya sabitleyin. 40 x 0.8 sayısal açıklıklı su daldırma objektif lensini doğrudan görünür bir tümör lezyonunun üzerine veya üzerine yerleştirin.

Dili, 60 miliwatt yoğunluğa ve 755 nanometre giriş dalga boyuna sahip titanyum safir lazer ile iki foton mikroskobu ile görüntüleyin. M kiraz sinyalini optimize etmek için, 15 ila 100 mikrometre arasındaki toplam doku derinliği boyunca bir mikrometre artımlı derinliklerde seri bir mikrometre lazer tarama görüntüleri toplayın. Bu konfigürasyon ile doku derinliği bir milimetreye kadar olan tümörler analiz edilebilir.

Görüntüleri yakalamak için görüntü taramayı kullanın. Tarama görüntüsü, XY galvanizli metrik tarama aynalarını kontrol etmek için iki kanallı bir raster tarama deseni çıktısı oluşturur ve aynı zamanda bir veri toplama kartı aracılığıyla fotoğraf çarpan tüplerinden aynı anda maksimum dört kanallı sinyal Girişi yakalar. Tarama görüntüsü, objektifin Z eksenini kontrol ederek Z yığını görüntülerini toplar ve tek veya döngüsel modda zaman atlamalı görüntüleri toplar.

Görüntüleri 16 bit derinliğe sahip tek bir TIF dosyasına kaydedin. Amira yazılımını kullanarak, Zs yığın görüntüleri kümesini içeren TIF dosyasını açarak tümör görüntü yığınlarını tek bir üç boyutlu görüntüye dönüştürün. Üç boyutlu bir görüntü oluşturma oluşturmak için TEX işlevini kullanın.

Birkaç küçük ayrışmış invaziv grup veya ig içeren büyük bir primer tümör görüntüsü, oluşturulan görüntüde muhtemelen mevcut olacaktır. Tümör hacmini ölçmek için, primer tümör alanının eşiğini tanımlayın ve görüntü yığınının her dilimi arka plan floresansını doğru şekilde tanımlayın ve ortadan kaldırın. Her invaziv grup için eşik prosedürünü tekrarlayın.

Primer tümör ve tüm ig'ler seçildikten sonra, primer tümör için hacim ölçümünün yanı sıra X, Y ve Z tümör OID koordinatlarını belirleyin. Igs'nin merkezi tümör noktasından uzaklıklarını hesaplamak için, ti eşittir N NT çarpı VT çarpı dt kullanarak tümör invaziv indeksini veya ti'yi hesaplayın. NT'nin görüntüdeki toplam ig sayısına eşit olduğu durumlarda, VT tüm ig'lerin toplam hacmine eşittir ve DT, tüm invaziv grupların primer tümörün merkezinden kat ettiği toplam mesafeye eşittir.

Orijinal 16 bit monokrom uç dosyalarının yazılım içindeki Nikon NIS öğelerine aktarılmasıyla daha fazla topografik ayrıntıya sahip üç boyutlu işlemeler oluşturulabilir. Bir görüntü yığınından bir ND dosyası oluşturun. Ardından, daha yüksek kaliteli işlemeler için piksel boyutunu belirtmek üzere belgeyi manuel olarak kalibre edin.

Z düzlemine ek dilimler ekleyin. Bu şekil, iki fotonlu bir görüntüden, NIS elemanlarından veya bir aynadan elde edilen ham verilerin bir örneğini göstermektedir. Bu şekilde gösterilen dil tümörlerinin ham verilerini yeniden oluşturmak için yazılım kullanılabilir.

Bu panel, Amira yazılımındaki TEX işlevini kullanarak üç boyutlu işlemenin bir örneğini gösterir. Burada, birincil tümörün yanı sıra birincil tümör merkezi veya oid'den gelen invaziv grupları tanımlamak için görüntü yığınından ayrı bir iki foton bölümünün eşiklenmesine bir örnek verilmiştir. Her eşik kesiti analiz edildikten sonra Amira, her bir istilacı grubun Centro'dan kat ettiği hacmi ve mesafeyi ölçer.

Bu veriler grafiksel olarak gösterilebilir ve tam tümör hücresi istilası seviyesi için sayısal değeri elde etmek için kullanılabilir. Burada gösterilen birincil bölgeye atfedilebilen bir şey, açıklanan protokolü kullanarak benzer bir tümörün üç boyutlu bir görüntüsüne kıyasla geleneksel patolojik immünohistokimya etiketlemesi ile görselleştirilen tümörlerin temsili görüntüleridir Dil çıkarma noktasından son 3D işlemeye kadar ustalaştıktan sonra, bu teknik, bu prosedür denenirken uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık iki saat içinde yapılabilir, Dilin iğne ile delinmemesine dikkat edin, böylece tümör hücrelerini kaybedin ve tümörün alınmasını engelleyin Bu prosedürü takiben. Terapötik bileşiklerin veya manipüle edilmiş protein seviyelerine sahip hücrelerin testi, ağız kanseri istilası üzerindeki etkinliklerini belirlemek için yapılabilir.

İn vivo bir ortamda, lentivirüs ile modifiye edilmiş insan tümör hücreleri ile çalışmanın, uygun KKD gibi tehlikeli önlemler olduğunu ve enjekte edilen farelerle çalışırken her zaman BSL iki sertifikalı laminer akış başlığında çalışmanın tehlikeli olduğunu unutmayın.