Name: Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Keşfedin HIV-1 gp120'ye karşı yüksek afiniteli RNA aptamerlerin nitroselüloz filtre SELEX yöntemiyle geliştirilmesini. Bu yöntem, hücre tipine özgü siRNA teslimatı için yeni anti-HIV terapötikleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer ve Lisa Scherer yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. CHO-EE ve CHO-gp160 hücre: Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH yoluyla elde edilen, Sağlık AI29329 ve aşağıdaki reaktifler JJR layık HL07470 National Institutes of hibe tarafından desteklenen doğrultusunda; pNL4-3 luc vektör; NIAID DAIDS, HIV-1 Bal gp120.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R ve JZ &quot;Hücre tipi HIV-1 tedavisi için özel aptamer siRNA dağıtım sistemi&quot; patenti var. USPTO, No.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, Yayın tarihi: 11 Haziran 2009.

In vitro ve böylece hedef moleküller 8 için son derece özel, sıkı bağlantı sağlayarak, özel ve istikrarlı bir üç boyutlu şekiller varsayıyorum nükleik asitler gelişti Aptamers . Düşük nanomolar afinitesi ve hedeflerine aptamers nefis özgüllüğü, in vivo görüntüleme ve tedavi 9, teşhis için çok yönlü araçlar olun . Hedeflenen siRNA teslimat için aptamer teknolojinin gelişi ile şimdi siRNA&#39;lar 10-12 reseptör aracılı endositoz aptamer bağlayıcı işlevi kullanmak için uyg...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> MF-Millipore membran filtreden </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Gözenek büyüklüğü 0.45 mikron </td></tr><tr><td> Swinnex Filtre sahibi </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm çapında </td></tr><tr><td> QIAquick Jel Ekstraksiyon Seti </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNA saflaştırılması </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 sütun </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 sütun </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA saflaştırılması </td></tr><tr><td> Taq PCR DNA polimeraz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> T7 transkripsiyon Kit DuraScribe </td><td> Epicentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> PCR dNTP </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonükleik asit, E.coli, transfer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA rakip </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L gp120 protein </td><td> AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı </td><td> 4961 </td><td> Hedef protein </td></tr><tr><td> Susturucu siRNA etiketleme kiti - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Asit fenol / kloroform 5 / 1 çözeltisi (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Kloroform / 24 / 1 Isopropanol çözümü </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Buzağı bağırsak fosfataz (CIP) </td><td> Yeni İngiltere Biolab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 polinükleotid kinaz </td><td> Yeni İngiltere Biolab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glikojen </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA yağış </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> % 40 AccuGel 19:01 </td><td> Milli Diagnostics </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Milli Diagnostics </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Amonyum persulfate (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Medya 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Bikarbonat solüsyonu,% 7.5 w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) ve (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM elzem olmayan bir amino asit (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 2.1 ile TA klonlama kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

hücre tipi sirna teslimat için özel anti-hiv gp120 aptamers geliştirme

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

HIV enfeksiyonu küresel salgın antiretroviral ajanlar ile yeni sınıflar için acil bir ihtiyaç yarattı. Tamamlayıcı RNA transkript ekspresyonunu inhibe güçlü yeteneği küçük bir müdahale (si) RNA&#39;lar, HIV dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için terapötikler yeni bir sınıf olarak istismar ediliyor. Birçok önceki raporlarda roman RNAi tabanlı anti-HIV/AIDS tedavi stratejileri önemli bir söz var olduğunu göstermiştir, ancak başarılı bir tedavi uygulaması ve siRNA&#39;lar klinik çevirisi kilit bir engel verimli teslimat. Özellikle, RNAi temelli tedaviler güvenliği ve etkinliği göz önünde bulundurularak, belirli bir hücre popülasyonları ya da doku hedeflenen hücre içi siRNA teslim yaklaşımı geliştirmek için son derece cazip. HIV-1 gp120 proteini, HIV-1 yüzeyinde bir glikoprotein zarf, CD4 hücrelerinin viral giriş önemli bir rol oynar. HIV-1 giriş tetikler ve hücre füzyonu başlatır gp120 ve CD4 etkileşimi ilaç keşfi için klinik olarak anlamlı bir anti-viral bir strateji olarak onaylanmıştır. Bu yazıda öncelikle 2&#39;-F modifiye anti-HIV RNA aptamers gp120 seçimi ve kimlik tartışacağız. Geleneksel bir nitroselüloz filtre SELEX yöntemi kullanarak, nanomolar afinite ile birçok yeni aptamers rasgele 50 nt RNA kütüphanesi izole edilmiştir. Başarılı bir şekilde yüksek bir afinite ile bağlı türler elde etmek için, dikkatli bir seçim darlığı koşulları ayarlayarak kontrol edilir. Seçilen aptamers özellikle bağlamak ve hızlı bir şekilde HIV-1 zarf proteini eksprese eden hücrelerin içine içselleştirilmiş. Ayrıca, tek başına aptamers HIV-1 enfektivite nötralize eder. En iyi aptamer A-1 dayanarak, biz de chimera aptamer ve siRNA bölümlerini hem de sahip olduğu güçlü anti-HIV faaliyetlerinin bir roman çift inhibitör fonksiyonu anti-gp120 aptamer-siRNA oluşturun. Ayrıca, HIV-1 ile enfekte hücrelerin içine siRNA hücre türüne özgü bir teslimat için gp120 aptamer siRNA kimeralar kullanmaktadır. Chimera Bu ikili işlevi, bastırmak, HIV-1 enfeksiyonu çeşitli nükleik asit terapötik ajanlar (aptamer ve siRNA) birleştirerek, hastalar için son derece aktif antiretroviral tedavinin (HAART) başarısız aptamer siRNA kimeralar çekici bir terapötik adaylar için önemli bir potansiyel gösterir.

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2&#39;-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.<em&gt; In vitro</em&gt; SELEX prosedürü. Chimera yeni bir çift inhibitör fonksiyonu anti-gp120 aptamer-siRNA oluşturulur ve sistemik anti-HIV tedavisi için önemli bir söz gösterir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

HIV enfeksiyonunun küresel epidemisi, yeni antiretroviral ajan sınıflarına yönelik acil bir ihtiyaç yaratmıştır. Küçük müdahale eden RNA'ların (siRNA) güçlü yeteneği...

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, nitrocellulose membran kullanarak HIV-1 GP120 proteini için in vitro RNA Aptima üretmektir. Bu işlem, PCR ve ardından gelen in vitro T7 transkripsiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak başlangıç DNA'sını ve rastgele RNA kütüphanesini hazırlamak için, hedef protein ve RNA kütüphanesinden oluşan karışım önceden ıslatılmış bir nitrocellulose filtreye uygulanır; bu işlem, bağlı RNA moleküllerinin bağlanmamış RNA türlerinden ayrılmasını sağlar.12 seleksiyon döngüsünün ardından, kütüphanedeki bireysel RNA aptima adaylarını belirlemek amacıyla RNA kütüphanesi klonlanır ve dizilenir. Jel kayma analizleri ve konfokal mikroskopiye dayanarak, nanomolar afiniteye sahip birkaç yeni aptimanın tanımlandığı sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, BET'ler veya kolon tabanlı izolasyon yöntemleri gibi mevcut ölçümler üzerindeki temel avantajı basit olmasıdır ve proteinin BET'lere immobilizasyonu gibi proteinin veya kütüphanelerin ön işlemden geçirilmesini gerektirmez. Anti HIV GP120 RNA aptamerlerinin izolasyonu için kullanılan RNA kütüphanesi, 50 nükleotidlik rastgele diziler içeren ticari olarak sentezlenmiş bir DNA kütüphanesinden hazırlanır.Tek zincirli DN

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

HIV-1 replikasyon döngüsünün entegrasyon sonrası adımlarını hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu yöntemler, yeni molekülleri taramak ve mevcut moleküllerin formatını optimize etmek için kullanışlıdır.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.

Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Keşfedin HIV-1 gp120'ye karşı yüksek afiniteli RNA aptamerlerin nitroselüloz filtre SELEX yöntemiyle geliştirilmesini. Bu yöntem, hücre tipine özgü siRNA teslimatı için yeni anti-HIV terapötikleri sunar.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Daha fazla video keşfet