Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, nitrocellulose membran kullanarak HIV-1 GP120 proteini için in vitro RNA Aptima üretmektir. Bu işlem, PCR ve ardından gelen in vitro T7 transkripsiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak başlangıç DNA'sını ve rastgele RNA kütüphanesini hazırlamak için, hedef protein ve RNA kütüphanesinden oluşan karışım önceden ıslatılmış bir nitrocellulose filtreye uygulanır; bu işlem, bağlı RNA moleküllerinin bağlanmamış RNA türlerinden ayrılmasını sağlar.

12 seleksiyon döngüsünün ardından, kütüphanedeki bireysel RNA aptima adaylarını belirlemek amacıyla RNA kütüphanesi klonlanır ve dizilenir. Jel kayma analizleri ve konfokal mikroskopiye dayanarak, nanomolar afiniteye sahip birkaç yeni aptimanın tanımlandığı sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, BET'ler veya kolon tabanlı izolasyon yöntemleri gibi mevcut ölçümler üzerindeki temel avantajı basit olmasıdır ve proteinin BET'lere immobilizasyonu gibi proteinin veya kütüphanelerin ön işlemden geçirilmesini gerektirmez. Anti HIV GP120 RNA aptamerlerinin izolasyonu için kullanılan RNA kütüphanesi, 50 nükleotidlik rastgele diziler içeren ticari olarak sentezlenmiş bir DNA kütüphanesinden hazırlanır.

Tek zincirli DNA oligo kütüphanesi dizisi 81 nükleotid uzunluğundadır. Bu şemada gösterildiği gibi, rastgele bölge, beş prime ucunda 30 tümör ve üç prime ucunda 16 MA şeklinde sabit bölgelerle çevrelenmiştir. Sabit bölgeler, in vitro transkripsiyon için T seven promotörünü ve R-T-P-C-R için bir üç prime etiketini içerir.

Tek zincirli DNA oligo rastgele kütüphanesini PCR ile çoğaltın; orijinal DNA kütüphanesinin bolluğunu korumak için PCR'ı 10 döngü ile sınırlayın. PCR reaksiyonlarının ardından, çoğaltılmış çift zincirli DNA havuzu bir jel saflaştırma kiti kullanılarak geri kazanılır. Ardından çift zincirli DNA, üretici talimatlarına uygun olarak cript kiti kullanılarak bir RNA kütüphanesine dönüştürülür; ribonükleaz dirençli RNA üretmek için transkripsiyon reaksiyon karışımındaki CTP ve UTP, iki floropirimidin CTP ve iki floropirimidin UTP ile değiştirilir.

Transkripsiyon reaksiyonları tamamlandığında, kalıp DNA'yı uzaklaştırmak için reaksiyonları DS one ile sindirin ve %8'lik poliakrilamid, yedi molar üre jeli ile saflaştırın. Son olarak, saflaştırılmış RNA kütüphanesini UV spektrofotometresi ile nicelleştirin. Optimas seçimi öncesinde, gerekli tampon çözeltileri hazırlayın ve uygun sıcaklıklarda saklayın.

Oda sıcaklığındaki Heaps tamponu ile -20 °C'deki RNA yeniden katlanma ve RNA bağlanma tamponları kullanılır. Seçimin ilk döngüsüne başlamadan önce, filtreyle oluşabilecek spesifik olmayan bağlanmaları en aza indirmek için rastgele RNA havuzunu oda sıcaklığında, önceden ıslatılmış bir nitrocellüloz filtreye 30 dakika boyunca ön olarak uygulayın. 30 dakika sonra nitrocellüloz filtreyi çıkarın.

Ön temizlemeden geçirilmiş rastgele RNA havuzu ile HIV one bowel GP one 20 proteinini düşük tuzlu RNA bağlama tamponu içinde birleştirin ve oda sıcaklığında döner bir platformda 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, reaksiyon karışımını önceden ıslatılmış bir nitroselüloz filtreden geçirin ve filtreye bağlı RNA'yı elüe etmek için 1 mL düşük tuzlu RNA bağlama tamponu ile yıkayın. Nitroselüloz membranı filtre tutucudan çıkarın.

Membrana 200 µL elu buffer ekleyin ve 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. RNA filtreden elüye edildikten sonra, tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin, RNA çözeltisini yeni bir tüpe aktarın ve elde edilen sıvıya fenol kloroform ekstraksiyonu uygulayın. RNA'yı konsantre etmek için bir MicroCon YM 30 kolonu kullanın ve geri kazanılan RNA'yı 20 µL RNase-free water ile elüye edin.

Geri kazanılan RNA havuzu daha sonra tersine çevrilir, transkribe edilir ve 15 döngü PCR ile amplifiye edilir. Amplifiye edilmiş çift zincirli havuz saflaştırıldıktan sonra, bir sonraki seçim turundan önce daha önce gösterildiği gibi yeni bir RNA havuzuna transkribe edilir. RNA havuzunu bir kat HBS tamponu içinde yeniden katlayın, üç dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın ve ardından yavaşça 37 °C'ye soğumasını bekleyin.

İnkübasyona 37 °C'de 10 dakika boyunca devam edin. Yeniden katlanmış RNA'yı adsorbe edin ve bir sonraki seçim turunda hedef HIV bowel GP one 20 proteini ile inkübe etmeden önce 30 dakika boyunca bir nitroselüloz filtreye çekin. Daha yüksek bağlanma afinitesine sahip aptamerleri başarıyla elde etmek için, seçim seçiciliği, seçim koşulları ayarlanarak dikkatle kontrol edilmelidir.

Seçim koşulları bu tabloda gösterilmiştir. Birinci ile dördüncü cellex turları için, ön temizlenmiş RNA havuzunu düşük tuzlu RNA bağlanma tamponu içerisinde hedef proteinle 30 dakika boyunca inkübe edin. Dördüncü cellex turundan sonra, cellex süreci ilerledikçe yüksek tuzlu RNA bağlanma tamponu kullanın.

Her döngüde aptamer seçiliminin dizginliğini artırmak için GP120 protein miktarını azaltın ve rakip maya tRNA miktarını artırın. HIV-1 GP120 aptamer seçiliminin ilerlemesi, bir filtre bağlama deneyi ile izlenir. Bu videoda, tüm seçilim döngüleri sonrası toplanan 12 RNA havuzu analiz edilecektir.

İlk olarak, her bir RNA havuzunu 37 °C'de bir saat boyunca buzağı intestinal fosfatazı ile işleme tabi tutarak başlangıçtaki beş prime trifosfatı uzaklaştırın. CIP ile işlem görmüş RNA'yı T4 polinükleotid kinaz ve P32 80 p ile etiketlemeye hazırlamak için 95 °C'de beş dakika ısıtın ve ardından buz üzerinde soğutun. RNA'nın etiketlenmesi, radyoaktivite içeren deneyler için tasarlanmış sıcak bir odada PNK tamponu, T4 polinükleotid kinaz, 1 µL gama P32 ATP ve 20 µL'ye tamamlayacak kadar su kullanılarak gerçekleştirilir. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, her reaksiyona 20 µL su ekleyin ve G 50 kolonu ile saflaştırın. Son olarak, 250 nM yeniden katlanmış nihai konsantrasyonda 40 µL işaretli RNA elde edin; her bir işaretli RNA havuzunu 1x HBS tamponu içerisinde 95 °C'de üç dakika boyunca ısıtın. Ardından, 30 ila 40 dakika sürecek şekilde 37 °C'ye soğumaya bırakın.

İnkübasyona 37 °C'de 10 dakika boyunca devam edin. RNA havuzu yeniden katlandığında, 100 µL'lik bir bağlanma reaksiyonu gerçekleştirin. Uç etiketli RNA havuzunu, GP one 20 proteini ve on kat molar fazlalıkta spesifik olmayan kompetitör TRNA ile yüksek tuzlu RNA bağlanma tamponunda birleştirip oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

30 dakikanın sonunda, bağlanma reaksiyonundan 50 microliters miktarını önceden ıslatılmış bir nitrocellulose filtre ile ayırın. Ardından filtreyi iki milliliters bağlanma tamponu ile yıkayın ve filtrede tutulan radyoaktiviteyi, bir girdi kontrol sayımı olarak çok amaçlı bir sintilasyon sayacı kullanarak sayın. Aynı zamanda, bağlanma reaksiyonunun geri kalan 50 microliters miktarı ile her seçilim döngüsünden sonraki RNA havuzunun bağlanma testi, HIV one, GP one 20 ilerlemesini izlemek için kompetitör TRNA ile bir filtre bağlanma testi kullanılarak analiz edilmiştir.

Optima'nın seçim bağlanma aktiviteleri, burada gösterildiği gibi, protein RNA kompleksinin filtre üzerinde tutulan girdi RNA'sının yüzdesi olarak hesaplanmıştır. Başlangıç RNA havuzu, membran üzerinde tutulan girdi RNA'sının yalnızca %0,1'ini göstermektedir. Ancak dokuz seçim turundan sonra, dokuzuncu RNA kütüphanesi girdi RNA'sının %9,72'sinin bağlandığını göstermektedir.

Ek seçim turları gerçekleştirilmesine rağmen, RNA havuzunun maksimum bağlanma düzeyine ulaşıldığını düşündüren başka bir zenginleşme gözlemlenmemiştir. RNA havuzlarının bağlanma aktiviteleri, jel kayma analizleri ile ayrıca doğrulanmıştır. Bu sonuçlar, hedef proteine karşı yüksek bağlanma özgüllüğüne sahip bazı ligandların bu RNA havuzlarında ardışık olarak zenginleştiğini göstermektedir.

Bu örnekte, RNA havuzunun maksimum bağlanma düzeyine 12. seçim turunun ardından ulaşıldığı için, 12. RNA havuzu en yüksek bağlanma aktivitesini göstermiştir; bu RNA havuzu cDNA'ya ters transkribe edilmiş ve ardından PCR ile çoğaltılmıştır. PCR ürünü daha sonra saflaştırılmış, bir TA klonlama vektörüne klonlanmış ve 140 klonun hizalanmasının ardından dizilenmiştir. Altı grup anti GP one 20 optiması tanımlanmıştır.

Bu tabloda yalnızca Aptima çekirdek bölgelerinin rastgele sekansları belirtilmiştir. Klonların yaklaşık %40'ı korunmuş bir sekans içermektedir. Doğal jel mobilite kayması analizi aracılığıyla kendi grupları içindeki göreceli bollukları nedeniyle, her gruptan daha ileri karakterizasyon için bir temsilci sekans seçilmiş ve bu temsilci aptamerlerin disosiyasyon sabiti KD değerleri hesaplanmıştır (örneğin, A1).

En iyi affibody'lerin görünür KD değeri 52 nanomolar'dır. Burada gösterildiği gibi. Seçilen bu affibody'ler, hedef HIV-1 gp120'ye seçici olarak bağlanabilirken, HIV-gp120 CM proteinine bağlanamazlar. Seçilen anti-gp120 optimaslarının bağlanma ve içselleştirme özelliklerini test etmek için HIV zar glikoproteini gp160'yı stabil olarak eksprese eden CHO G160 hücreleri kullanılmıştır.

Bu hücreler, zar işleme için gerekli olan gag kodlu proteazlardan yoksun oldukları için GP160'ı GP120 ve GP41'e dönüştürmezler; akış sitometrisi analizi, S3 etiketli aptamerlerin spesifik olarak CHO GP160 hücrelerine bağlandığını, ancak GP160 eksprese etmeyen kontrol CHO EE hücrelerine bağlanmadığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, gerçek zamanlı canlı hücre Z-ekseni konfokal mikroskopisi, iki saatlik inkübasyonun ardından S3 etiketli aptamerlerin seçici olarak CHO GP160 hücreleri tarafından internalize edildiğini, ancak CHO EE kontrol hücreleri tarafından edilmediğini göstermektedir. Aptamerlerin sitoplazma içinde kümelendiği de gözlemlenmiş olup, bu durum GP120 aptamerinin hücrelere reseptör aracılı endositoz yoluyla girebileceğini düşündürmektedir.

Son olarak, bu videoyu izledikten sonra, RNA Abers'ı izole etmek için saha tabanlı ölçümlerin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.