Name: Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Keşfedin HIV-1 gp120'ye karşı yüksek afiniteli RNA aptamerlerin nitroselüloz filtre SELEX yöntemiyle geliştirilmesini. Bu yöntem, hücre tipine özgü siRNA teslimatı için yeni anti-HIV terapötikleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer ve Lisa Scherer yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. CHO-EE ve CHO-gp160 hücre: Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH yoluyla elde edilen, Sağlık AI29329 ve aşağıdaki reaktifler JJR layık HL07470 National Institutes of hibe tarafından desteklenen doğrultusunda; pNL4-3 luc vektör; NIAID DAIDS, HIV-1 Bal gp120.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R ve JZ &quot;Hücre tipi HIV-1 tedavisi için özel aptamer siRNA dağıtım sistemi&quot; patenti var. USPTO, No.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, Yayın tarihi: 11 Haziran 2009.

In vitro ve böylece hedef moleküller 8 için son derece özel, sıkı bağlantı sağlayarak, özel ve istikrarlı bir üç boyutlu şekiller varsayıyorum nükleik asitler gelişti Aptamers . Düşük nanomolar afinitesi ve hedeflerine aptamers nefis özgüllüğü, in vivo görüntüleme ve tedavi 9, teşhis için çok yönlü araçlar olun . Hedeflenen siRNA teslimat için aptamer teknolojinin gelişi ile şimdi siRNA&#39;lar 10-12 reseptör aracılı endositoz aptamer bağlayıcı işlevi kullanmak için uyg...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> MF-Millipore membran filtreden </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Gözenek büyüklüğü 0.45 mikron </td></tr><tr><td> Swinnex Filtre sahibi </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm çapında </td></tr><tr><td> QIAquick Jel Ekstraksiyon Seti </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> DNA saflaştırılması </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 sütun </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> RNA konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 sütun </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> RNA saflaştırılması </td></tr><tr><td> Taq PCR DNA polimeraz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> T7 transkripsiyon Kit DuraScribe </td><td> Epicentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> PCR dNTP </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonükleik asit, E.coli, transfer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> tRNA rakip </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L gp120 protein </td><td> AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı </td><td> 4961 </td><td> Hedef protein </td></tr><tr><td> Susturucu siRNA etiketleme kiti - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Asit fenol / kloroform 5 / 1 çözeltisi (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Kloroform / 24 / 1 Isopropanol çözümü </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Buzağı bağırsak fosfataz (CIP) </td><td> Yeni İngiltere Biolab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 polinükleotid kinaz </td><td> Yeni İngiltere Biolab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glikojen </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA yağış </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> % 40 AccuGel 19:01 </td><td> Milli Diagnostics </td><td> EC-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Milli Diagnostics </td><td> EC-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Amonyum persulfate (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Medya 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Bikarbonat solüsyonu,% 7.5 w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) ve (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM elzem olmayan bir amino asit (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 2.1 ile TA klonlama kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

hücre tipi sirna teslimat için özel anti-hiv gp120 aptamers geliştirme

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

HIV enfeksiyonu küresel salgın antiretroviral ajanlar ile yeni sınıflar için acil bir ihtiyaç yarattı. Tamamlayıcı RNA transkript ekspresyonunu inhibe güçlü yeteneği küçük bir müdahale (si) RNA&#39;lar, HIV dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için terapötikler yeni bir sınıf olarak istismar ediliyor. Birçok önceki raporlarda roman RNAi tabanlı anti-HIV/AIDS tedavi stratejileri önemli bir söz var olduğunu göstermiştir, ancak başarılı bir tedavi uygulaması ve siRNA&#39;lar klinik çevirisi kilit bir engel verimli teslimat. Özellikle, RNAi temelli tedaviler güvenliği ve etkinliği göz önünde bulundurularak, belirli bir hücre popülasyonları ya da doku hedeflenen hücre içi siRNA teslim yaklaşımı geliştirmek için son derece cazip. HIV-1 gp120 proteini, HIV-1 yüzeyinde bir glikoprotein zarf, CD4 hücrelerinin viral giriş önemli bir rol oynar. HIV-1 giriş tetikler ve hücre füzyonu başlatır gp120 ve CD4 etkileşimi ilaç keşfi için klinik olarak anlamlı bir anti-viral bir strateji olarak onaylanmıştır. Bu yazıda öncelikle 2&#39;-F modifiye anti-HIV RNA aptamers gp120 seçimi ve kimlik tartışacağız. Geleneksel bir nitroselüloz filtre SELEX yöntemi kullanarak, nanomolar afinite ile birçok yeni aptamers rasgele 50 nt RNA kütüphanesi izole edilmiştir. Başarılı bir şekilde yüksek bir afinite ile bağlı türler elde etmek için, dikkatli bir seçim darlığı koşulları ayarlayarak kontrol edilir. Seçilen aptamers özellikle bağlamak ve hızlı bir şekilde HIV-1 zarf proteini eksprese eden hücrelerin içine içselleştirilmiş. Ayrıca, tek başına aptamers HIV-1 enfektivite nötralize eder. En iyi aptamer A-1 dayanarak, biz de chimera aptamer ve siRNA bölümlerini hem de sahip olduğu güçlü anti-HIV faaliyetlerinin bir roman çift inhibitör fonksiyonu anti-gp120 aptamer-siRNA oluşturun. Ayrıca, HIV-1 ile enfekte hücrelerin içine siRNA hücre türüne özgü bir teslimat için gp120 aptamer siRNA kimeralar kullanmaktadır. Chimera Bu ikili işlevi, bastırmak, HIV-1 enfeksiyonu çeşitli nükleik asit terapötik ajanlar (aptamer ve siRNA) birleştirerek, hastalar için son derece aktif antiretroviral tedavinin (HAART) başarısız aptamer siRNA kimeralar çekici bir terapötik adaylar için önemli bir potansiyel gösterir.

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2&#39;-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.<em&gt; In vitro</em&gt; SELEX prosedürü. Chimera yeni bir çift inhibitör fonksiyonu anti-gp120 aptamer-siRNA oluşturulur ve sistemik anti-HIV tedavisi için önemli bir söz gösterir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

HIV enfeksiyonunun küresel epidemisi, yeni antiretroviral ajan sınıflarına yönelik acil bir ihtiyaç yaratmıştır. Küçük müdahale eden RNA'ların (siRNA) güçlü yeteneği...

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, nitrocellulose membran kullanarak HIV-1 GP120 proteini için in vitro RNA Aptima üretmektir. Bu işlem, PCR ve ardından gelen in vitro T7 transkripsiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak başlangıç DNA'sını ve rastgele RNA kütüphanesini hazırlamak için, hedef protein ve RNA kütüphanesinden oluşan karışım önceden ıslatılmış bir nitrocellulose filtreye uygulanır; bu işlem, bağlı RNA moleküllerinin bağlanmamış RNA türlerinden ayrılmasını sağlar.12 seleksiyon döngüsünün ardından, kütüphanedeki bireysel RNA aptima adaylarını belirlemek amacıyla RNA kütüphanesi klonlanır ve dizilenir. Jel kayma analizleri ve konfokal mikroskopiye dayanarak, nanomolar afiniteye sahip birkaç yeni aptimanın tanımlandığı sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, BET'ler veya kolon tabanlı izolasyon yöntemleri gibi mevcut ölçümler üzerindeki temel avantajı basit olmasıdır ve proteinin BET'lere immobilizasyonu gibi proteinin veya kütüphanelerin ön işlemden geçirilmesini gerektirmez. Anti HIV GP120 RNA aptamerlerinin izolasyonu için kullanılan RNA kütüphanesi, 50 nükleotidlik rastgele diziler içeren ticari olarak sentezlenmiş bir DNA kütüphanesinden hazırlanır.Tek zincirli DNA oligo kütüphanesi dizisi 81 nükleotid uzunluğundadır. Bu şemada gösterildiği gibi, rastgele bölge, beş prime ucunda 30 tümör ve üç prime ucunda 16 MA şeklinde sabit bölgelerle çevrelenmiştir. Sabit bölgeler, in vitro transkripsiyon için T seven promotörünü ve R-T-P-C-R için bir üç prime etiketini içerir.Tek zincirli DNA oligo rastgele kütüphanesini PCR ile çoğaltın; orijinal DNA kütüphanesinin bolluğunu korumak için PCR'ı 10 döngü ile sınırlayın. PCR reaksiyonlarının ardından, çoğaltılmış çift zincirli DNA havuzu bir jel saflaştırma kiti kullanılarak geri kazanılır. Ardından çift zincirli DNA, üretici talimatlarına uygun olarak cript kiti kullanılarak bir RNA kütüphanesine dönüştürülür; ribonükleaz dirençli RNA üretmek için transkripsiyon reaksiyon karışımındaki CTP ve UTP, iki floropirimidin CTP ve iki floropirimidin UTP ile değiştirilir.Transkripsiyon reaksiyonları tamamlandığında, kalıp DNA'yı uzaklaştırmak için reaksiyonları DS one ile sindirin ve %8'lik poliakrilamid, yedi molar üre jeli ile saflaştırın. Son olarak, saflaştırılmış RNA kütüphanesini UV spektrofotometresi ile nicelleştirin. Optimas seçimi öncesinde, gerekli tampon çözeltileri hazırlayın ve uygun sıcaklıklarda saklayın.Oda sıcaklığındaki Heaps tamponu ile -20 °C'deki RNA yeniden katlanma ve RNA bağlanma tamponları kullanılır. Seçimin ilk döngüsüne başlamadan önce, filtreyle oluşabilecek spesifik olmayan bağlanmaları en aza indirmek için rastgele RNA havuzunu oda sıcaklığında, önceden ıslatılmış bir nitrocellüloz filtreye 30 dakika boyunca ön olarak uygulayın. 30 dakika sonra nitrocellüloz filtreyi çıkarın.Ön temizlemeden geçirilmiş rastgele RNA havuzu ile HIV one bowel GP one 20 proteinini düşük tuzlu RNA bağlama tamponu içinde birleştirin ve oda sıcaklığında döner bir platformda 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, reaksiyon karışımını önceden ıslatılmış bir nitroselüloz filtreden geçirin ve filtreye bağlı RNA'yı elüe etmek için 1 mL düşük tuzlu RNA bağlama tamponu ile yıkayın. Nitroselüloz membranı filtre tutucudan çıkarın.Membrana 200 µL elu buffer ekleyin ve 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. RNA filtreden elüye edildikten sonra, tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin, RNA çözeltisini yeni bir tüpe aktarın ve elde edilen sıvıya fenol kloroform ekstraksiyonu uygulayın. RNA'yı konsantre etmek için bir MicroCon YM 30 kolonu kullanın ve geri kazanılan RNA'yı 20 µL RNase-free water ile elüye edin.Geri kazanılan RNA havuzu daha sonra tersine çevrilir, transkribe edilir ve 15 döngü PCR ile amplifiye edilir. Amplifiye edilmiş çift zincirli havuz saflaştırıldıktan sonra, bir sonraki seçim turundan önce daha önce gösterildiği gibi yeni bir RNA havuzuna transkribe edilir. RNA havuzunu bir kat HBS tamponu içinde yeniden katlayın, üç dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın ve ardından yavaşça 37 °C'ye soğumasını bekleyin.İnkübasyona 37 °C'de 10 dakika boyunca devam edin. Yeniden katlanmış RNA'yı adsorbe edin ve bir sonraki seçim turunda hedef HIV bowel GP one 20 proteini ile inkübe etmeden önce 30 dakika boyunca bir nitroselüloz filtreye çekin. Daha yüksek bağlanma afinitesine sahip aptamerleri başarıyla elde etmek için, seçim seçiciliği, seçim koşulları ayarlanarak dikkatle kontrol edilmelidir.Seçim koşulları bu tabloda gösterilmiştir. Birinci ile dördüncü cellex turları için, ön temizlenmiş RNA havuzunu düşük tuzlu RNA bağlanma tamponu içerisinde hedef proteinle 30 dakika boyunca inkübe edin. Dördüncü cellex turundan sonra, cellex süreci ilerledikçe yüksek tuzlu RNA bağlanma tamponu kullanın.Her döngüde aptamer seçiliminin dizginliğini artırmak için GP120 protein miktarını azaltın ve rakip maya tRNA miktarını artırın. HIV-1 GP120 aptamer seçiliminin ilerlemesi, bir filtre bağlama deneyi ile izlenir. Bu videoda, tüm seçilim döngüleri sonrası toplanan 12 RNA havuzu analiz edilecektir.İlk olarak, her bir RNA havuzunu 37 °C'de bir saat boyunca buzağı intestinal fosfatazı ile işleme tabi tutarak başlangıçtaki beş prime trifosfatı uzaklaştırın. CIP ile işlem görmüş RNA'yı T4 polinükleotid kinaz ve P32 80 p ile etiketlemeye hazırlamak için 95 °C'de beş dakika ısıtın ve ardından buz üzerinde soğutun. RNA'nın etiketlenmesi, radyoaktivite içeren deneyler için tasarlanmış sıcak bir odada PNK tamponu, T4 polinükleotid kinaz, 1 µL gama P32 ATP ve 20 µL'ye tamamlayacak kadar su kullanılarak gerçekleştirilir. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.30 dakika sonra, her reaksiyona 20 µL su ekleyin ve G 50 kolonu ile saflaştırın. Son olarak, 250 nM yeniden katlanmış nihai konsantrasyonda 40 µL işaretli RNA elde edin; her bir işaretli RNA havuzunu 1x HBS tamponu içerisinde 95 °C'de üç dakika boyunca ısıtın. Ardından, 30 ila 40 dakika sürecek şekilde 37 °C'ye soğumaya bırakın.İnkübasyona 37 °C'de 10 dakika boyunca devam edin. RNA havuzu yeniden katlandığında, 100 µL'lik bir bağlanma reaksiyonu gerçekleştirin. Uç etiketli RNA havuzunu, GP one 20 proteini ve on kat molar fazlalıkta spesifik olmayan kompetitör TRNA ile yüksek tuzlu RNA bağlanma tamponunda birleştirip oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.30 dakikanın sonunda, bağlanma reaksiyonundan 50 microliters miktarını önceden ıslatılmış bir nitrocellulose filtre ile ayırın. Ardından filtreyi iki milliliters bağlanma tamponu ile yıkayın ve filtrede tutulan radyoaktiviteyi, bir girdi kontrol sayımı olarak çok amaçlı bir sintilasyon sayacı kullanarak sayın. Aynı zamanda, bağlanma reaksiyonunun geri kalan 50 microliters miktarı ile her seçilim döngüsünden sonraki RNA havuzunun bağlanma testi, HIV one, GP one 20 ilerlemesini izlemek için kompetitör TRNA ile bir filtre bağlanma testi kullanılarak analiz edilmiştir.Optima'nın seçim bağlanma aktiviteleri, burada gösterildiği gibi, protein RNA kompleksinin filtre üzerinde tutulan girdi RNA'sının yüzdesi olarak hesaplanmıştır. Başlangıç RNA havuzu, membran üzerinde tutulan girdi RNA'sının yalnızca %0,1'ini göstermektedir. Ancak dokuz seçim turundan sonra, dokuzuncu RNA kütüphanesi girdi RNA'sının %9,72'sinin bağlandığını göstermektedir.Ek seçim turları gerçekleştirilmesine rağmen, RNA havuzunun maksimum bağlanma düzeyine ulaşıldığını düşündüren başka bir zenginleşme gözlemlenmemiştir. RNA havuzlarının bağlanma aktiviteleri, jel kayma analizleri ile ayrıca doğrulanmıştır. Bu sonuçlar, hedef proteine karşı yüksek bağlanma özgüllüğüne sahip bazı ligandların bu RNA havuzlarında ardışık olarak zenginleştiğini göstermektedir.Bu örnekte, RNA havuzunun maksimum bağlanma düzeyine 12. seçim turunun ardından ulaşıldığı için, 12. RNA havuzu en yüksek bağlanma aktivitesini göstermiştir; bu RNA havuzu cDNA'ya ters transkribe edilmiş ve ardından PCR ile çoğaltılmıştır. PCR ürünü daha sonra saflaştırılmış, bir TA klonlama vektörüne klonlanmış ve 140 klonun hizalanmasının ardından dizilenmiştir. Altı grup anti GP one 20 optiması tanımlanmıştır.Bu tabloda yalnızca Aptima çekirdek bölgelerinin rastgele sekansları belirtilmiştir. Klonların yaklaşık %40'ı korunmuş bir sekans içermektedir. Doğal jel mobilite kayması analizi aracılığıyla kendi grupları içindeki göreceli bollukları nedeniyle, her gruptan daha ileri karakterizasyon için bir temsilci sekans seçilmiş ve bu temsilci aptamerlerin disosiyasyon sabiti KD değerleri hesaplanmıştır (örneğin, A1).En iyi affibody'lerin görünür KD değeri 52 nanomolar'dır. Burada gösterildiği gibi. Seçilen bu affibody'ler, hedef HIV-1 gp120'ye seçici olarak bağlanabilirken, HIV-gp120 CM proteinine bağlanamazlar. Seçilen anti-gp120 optimaslarının bağlanma ve içselleştirme özelliklerini test etmek için HIV zar glikoproteini gp160'yı stabil olarak eksprese eden CHO G160 hücreleri kullanılmıştır.Bu hücreler, zar işleme için gerekli olan gag kodlu proteazlardan yoksun oldukları için GP160'ı GP120 ve GP41'e dönüştürmezler; akış sitometrisi analizi, S3 etiketli aptamerlerin spesifik olarak CHO GP160 hücrelerine bağlandığını, ancak GP160 eksprese etmeyen kontrol CHO EE hücrelerine bağlanmadığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, gerçek zamanlı canlı hücre Z-ekseni konfokal mikroskopisi, iki saatlik inkübasyonun ardından S3 etiketli aptamerlerin seçici olarak CHO GP160 hücreleri tarafından internalize edildiğini, ancak CHO EE kontrol hücreleri tarafından edilmediğini göstermektedir. Aptamerlerin sitoplazma içinde kümelendiği de gözlemlenmiş olup, bu durum GP120 aptamerinin hücrelere reseptör aracılı endositoz yoluyla girebileceğini düşündürmektedir.Son olarak, bu videoyu izledikten sonra, RNA Abers'ı izole etmek için saha tabanlı ölçümlerin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

HIV-1 replikasyon döngüsünün entegrasyon sonrası adımlarını hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu yöntemler, yeni molekülleri taramak ve mevcut moleküllerin formatını optimize etmek için kullanışlıdır.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Keşfedin HIV-1 gp120'ye karşı yüksek afiniteli RNA aptamerlerin nitroselüloz filtre SELEX yöntemiyle geliştirilmesini. Bu yöntem, hücre tipine özgü siRNA teslimatı için yeni anti-HIV terapötikleri sunar.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Daha fazla video keşfet