Name: Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Öğrenin, palatal genişleticilerden oral biyofilm örneklerini FISH ve CLSM teknikleriyle analiz etmeyi. Bu yöntem, bakteri topluluklarının yapısal ve bileşimsel analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Hijyen Viyana Tıp Üniversitesi Graz tarafından desteklenmiştir. Tüm denekler bilgilendirilmiş onam verdi. Kurumsal çalışma protokolü ile ilgili onayı Üniversitesi Tıp Fakültesi Graz elde edildi.

1. Örnek toplama <ol><li> 4 ay sonra intraoral hizmeti sabit damak genişleticiler çıkarın. NOLA Kuru Alan Sistemi (Şekil 1 ve 2) çıkarmadan önce aletleri izole etmek için kullanın. </li><li> Kontaminasyon (Şekil 3 ve 4) eklemeden genişleticiler kaldırmak için steril pense, eldiven ve tepsileri kullanın. </li><li> -20 ° C'de Sarstedt 120 ml flakon Mağaza nesneleri 24 saat içinde laboratuvara buz ve süreç ele alalım. </li></ol> 2. Biyofilm fiksasyon <ol><li> Biyofilm gevreği steril bir bisturi ile kazıyın, veya steril forseps ile parçaları toplamak. </li><li> Örnek kaplıdır kadar% 4 PFA çözüm buz ekleyin. </li><li> Karışım +4 ° C'de 3 ila 12 saat boyunca (donma yok). Daha uzun fiksasyon kez veya daha fazla fiksasyon sıcaklıklarda oligonükleotid problar daha az geçirgen gram-negatif hücre hücre zarflar hale getirebilir. </li><li> PFA çözüm çıkarın ve buz 1X PBS ile yıkayın. R bu adımı 2-3 kez tekrarlayınartık PFA aldır. </li><li> 1 vol örnek süspanse edin. buz 1X PBS ve eklemek 1 vol. buz% 96 (v / v) etanol. </li><li> -20 ° C'de örnek Mağaza Bu protokole göre sabit Örnekleri yıl birkaç ay saklanabilir. </li></ol> 3. Sabit Örnekler, Dehidrasyon <ol><li> Bir mikroskop lamı PFA sabit numune 5-30 ul uygulayın. </li><li> Kuru 46 at ° C yaklaşık 15 dakika veya daha uzun süre oda sıcaklığında. Lizozim ve formamid çözülme. </li><li> Böylece hücre duvarlarında kısmi yıkım tarafından problar hücre içine nüfuz kolaylaştırılması, 10 dakika oda sıcaklığında lizozim (1mg/ml) 250 ul ekleyin. </li><li> % 50,% 80 ve% 96 (v / v) her biri 3 dakika etanol içine Lamı. Etanol konsantrasyonu serisi dehydrating etkisi, hücre zarları parçalanır. </li><li> 46 ° C 'de 10 dakika süreyle slaytlar kurulayın. </li></ol> 4. In-situ hibridizasyon <ol><li> 1 ml hazırlayıntaze hibridizasyon tamponu (bkz. Tablo 1 konsantrasyonları için). Bu çalışmada kullanılan Formamid dağılımı:% 10 (EUBmix)% 20 (Bac303, POGI, MUT590) veya% 45 (LGCmix). </li><li> Oligonükleotid prob çözümleri çözülme. Çözülmüş probları buz üzerinde tutulmalıdır ve ışıktan korunmalıdır. </li><li> Her prob hibridizasyon tampon 200 ul 2 ul ekleyin, iyice karıştırın ve kurutulmuş örnek bir mikroskop lamı üzerine karışımı uygulayabilirsiniz. </li><li> Kare bir Petri kabı içine, bir parça kağıt mendil koyun ve kalan hibridizasyon tamponu kağıt mendil üzerine dökün. </li><li> Hemen yemeğin içine slayt yatay yerleştirmek ve tabak kapatın. 46 ° C'de 1-5 saat (90 dakika çoğu durumda yeterli olacaktır) bir fırında inkübe edin. Bir nem odası olarak çanak işlevleri slayt hibridizasyon çözüm buharlaşmasını önler. Özellikle, formamid, buharlaşma, non-spesifik prob bağlayıcı olmayan hedef hücreleri neden olabilir. </li><li> 50 ml yıkama tamponu (bkz. Tablo 2 conce için hazırlayınntrations). 48 50 ml tüp ve ön ısıtma yıkama tamponu hazırlayın ° C su banyosunda. Yıkama 48 ° C yapılır </li><li> Hibridizasyon fırın slayt çanak çıkarın. Hibridizasyon tamponu önceden ısıtılmış çamaşır tampon küçük bir hacmi ile hemen yıkayın ve yıkama tampon kalan slayt aktarmak. </li><li> 48 ° C'de 10-15 dakika süreyle su banyosunda inkübe geri yıkama tampon ve slayt içeren tüp yerleştirin. </li><li> Tüpten slayt çıkarın ve kalan yıkama tampon ortadan kaldırmak için 2-3 saniye boyunca buz gibi GKD 2 O içine batırın. </li><li> Mümkün olduğunca çabuk slayt (basınçlı hava kullanılması tavsiye edilir) Hava kurulayın. Hızlı kuruyan prob disosiasyon azaltacaktır. </li><li> Kurutulmuş slaytlar prob haiz floresan sinyal kaybı olmadan birkaç hafta, -20 ° C'de karanlıkta saklanabilir. </li></ol> 5. Mikroskopi <ol><li> Sonra FISH ve yıkama, Applantifadent yakın bir slaytın sol ve sağ uçları (dondurulmuş dilim bu adımı önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır) y iki damla. </li><li> Mikroskop kapağının üstünde kayma ve antifadent tüm slayt yayılmış kadar bekleyin yerleştirin. Antifadent aşırı miktarda mikroskopta görüntü bulanıklığını unutmayın. </li><li> Uygun filtreler veya lazer ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskop altında örnekleri dikkate alınmalıdır. Biz Leica TCS birimi (HCX PL APO/63x, NA 1.2) kullanılır. Veriler, IMARIS veya AMIRA yazılım ile analiz edilebilir. </li><li> Prob haiz floresan düşmeye başlamadan önce antifadent içinde gömülü Slaytlar +4 ° C (donma yok) 7 güne kadar saklanabilir. Alternatif olarak, antifadent GKD 2 O ile kaldırılır ve kurutulmuş slaytlar, uzun bir süre için -20 ° C'de saklanabilir . </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: (Sabit ortodontik aletler kapalı biyofilm KazımaŞekil 5), doğrudan mikroskopi için kaplı cam Slaytlarınıza melezleşmiştir olabilir uygun gevreği (Şekil 6) elde edilir. Bu şekilde, farklı etiketli spesifik problar (Şekil 7 ve 8) ile etiketleme bakteriyel rRNA orobiome bakterilerin farklı gruplar tarafından kendi doğal üç boyutlu ortamda tespit edilebilir. Şekil 7, biyofilm EUBmix (yeşil, tüm bakteriler) ve LGCmix (sarı, Firmicutes) ile boyandı. , Sarı ve mavi ile boyandı Firmicutes, yeşil görünür. Şekil 8, biyofilm EUBmix (kırmızı, bakteri), Bac303 (mavi, Bacteroidetes) ve POGI (sarı, Porphyromonas gingivalis) ile boyandı. DNA ve üst üste üç probları bağlamak Porphyromonas gingivalis, sarımsı beyaz gösterilir renkleri beyaz bir sinyal sonuçları. Bakteri grupları arasında morfolojik farklılıklar da tespit edilebilir (Şekil 9 ve 10). Coccoid bakteriler büyük kümeler (yeşil, tüm ba EUBmix ile boyama yapıldı Şekil 9 gösterilmiştircteria). Oral bakterilerin farklı şekiller coccoid ve ipliksi bakteri EUBmix (kırmızı) ile boyama ile ayırt edilebilir Şekil 10, görüntülendi. Ayrıca, biyofilm tipik bir mantar benzeri bir yapı, 3D modelleme, CLSM veri (Şekil 11 ve 12) ile <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">işlenebilir 3D modelleme bir film izlemek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. in situ palatal genişletici düzeltildi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Nola Kuru Alan Sistemi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 kerpeten, eldiven ve tepsi, sterilize edilmiştir . <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. genişletici kaldırıldı. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 steril bir bisturi ile biyofilm kapalı Kazıma. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 Reçine gevreği doğrudan kaplı cam Slaytlarınıza melezleşmiştir. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7 CLSM görüntü: farklılaşma belirli bir bakteri grubu. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (yeşil, tüm bakteriler) ve LGCmix (sarı, Firmicutes) ile boyandı. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8 CLSM görüntü: farklılaşma belirli bir bakteri grubu. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (kırmızı, bakteri), Bac303 (mavi, Bacteroi ile boyanmışdetes) ve (sarı, Porphyromonas gingivalis) POGI. <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 9"> Şekil 9 CLSM resim: özel morfolojileri farklılaşma. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (yeşil, tüm bakteriler) ile boyandı. Coccoid bakteriler büyük kümeler (oklar). <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 10"> Şekil 10 CLSM görüntüler: özel morfolojileri farklılaşma. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (kırmızı, bakteri) ile boyandı. Coccoid (aşağıda ok) ve ipliksi bakteri (yukarı ok) ayırt edilebilir. <img alt="Şekil 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 11"> Şekil 11 Mantar yapısı, aşağıdan 3D görünümleri. EUBmix ve prosedür ile boyanan biyofilm gevreği (ortodontik cihaz yüzey kazınmalı), yığınlarIMARIS (CLSM resim) ile ssed. <img alt="Şekil 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 11"> Şekil 12 Mantar yapısı, 3D yan görünümü. IMARIS (CLSM resim) ile işlenmiş biyofilm gevreği (ortodontik cihaz yüzey kazınmalı) yığınlar. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Hibridizasyon tamponu (200 ul) </td></tr><tr><td> Formamid konsantrasyon </td><td> % 10 </td><td> % 20 </td><td> % 45 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> % 2 SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Herhangi bir FISH probu </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tablo 1 hibridizasyon tamponu bileşenleri (ul konsantrasyonları). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Yıkama tamponu (50 ml) </td></tr><tr><td> Formamid konsantrasyon </td><td> % 10 </td><td> % 20 </td><td> % 45 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> GKD 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> Tablo 2, yıkama tampon bileşenleri (ul konsantrasyonları) . Film 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">film izlemek için tıklayınız.</a>

<ol><li>Sunde, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+bacteria+in+periapical+lesions+of+asymptomatic+root-filled+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth.</a> Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).</li>
<li>Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marine+fireworm+Hermodice+carunculata+is+a+winter+reservoir+and+spring-summer+vector+for+the+coral-bleaching+pathogen+Vibrio+shiloi%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi.</a> Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+among+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Communication among oral bacteria.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).</li>
<li>Zijnge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+biofilm+architecture+on+natural+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oral biofilm architecture on natural teeth.</a> PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluorescent+in+situ+hybridization+for+the+specific+detection+and+quantification+of+oral+streptococci+in+dental+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque.</a> J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).</li>
<li>Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+in+dental+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions in dental biofilm development.</a> J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).</li>
<li>Jung, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+initial+bacterial+colonization+on+dentine+and+enamel+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ.</a> J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).</li>
<li>Al-Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+of+enamel+in+situ+investigated+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization.</a> J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).</li>
<li>Bryers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Medical biofilms.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).</li>
<li>Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+the+bacterial+community+associated+with+the+reindeer+lichen+Cladonia+arbuscula+reveals+predominance+of+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).</li>
<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+biofilm+formation+and+the+effects+of+antimicrobial+agents+on+orthodontic+bonding+materials+in+a+parallel+plate+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Orthod%22%5BJournal%5D)">Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber.</a> Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).</li>
<li>Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes%3A+new+features+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007.</a> Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).</li>
<li>Diaz, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).</li>
<li>Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+streptococci+and+other+bacteria+in+initial+dental+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+and+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization.</a> Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interactions+and+successions+during+plaque+development%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology%22%5BJournal%5D)">Bacterial interactions and successions during plaque development.</a> Periodontology. 42, 47-79 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+multispecies+biofilm+development+and+the+key+role+of+cell-cell+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).</li>
<li>Chalmers, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+monitoring+the+development+of+bacterial+biofilms+in+human+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets.</a> FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).</li>
<li>Moter, A., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+for+direct+visualization+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.</a> J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Açıklanan protokol burada, sert malzemeler için toplanan boyama biyofilm yüksek uygulanabilir bir yaklaşımdır. Örnekleme ve hibridizasyon en kritik adımlar. Örnekleme sırasında, bakım, yeterli kalınlıkta dilimler biyofilm yapısı bozulmadan kalmasını sağlamak için toplanan alınmalıdır. Hibridizasyon sırasında, böylece kaçınarak, non-spesifik floresan etiketli probları bağlama, ya da bağlayıcı kaybı, aşırı sıcaklık dalgalanmaları önlemek için çok önemlidir. Bu BALIK protokol Bileşiminde bozmadan cam slaytlar doğrudan normal heterojen biyofilm leke zarif bir yöntemdir. Slaytlar hemen mikroskopi için bir kez daha örnek taşımak için bir gerek kalmadan kullanılabilir. Bu yolla, Tüplerde boyama üzerinde bir iyileşme biyofilm uygulanmakta olan daha az kesme kuvveti elde edilir. &gt; 50 mikron kalınlığında Dilimleri Bu şekilde hazırlanan ve araştırılmalıdır.

floresan in-situ hibridizasyon ve konfokal lazer tarama mikroskopi palatal genişleticilerden oral biyofilm analizi

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Doğal heterojen biyofilm Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) onları situ hibridizasyon (FISH) floresan olma boyama teknikleri, geniş bir ürün yelpazesiyle bugün kolaylaştırmıştır. 1,2 oral biyofilm örnekleri sabit toplanan hangi bir pilot çalışma gerçekleştirilmiştir FISH, üç boyutlu bir organizasyon doğal biyofilm ve plak birikimi değerlendirmek için objektif ortodontik aletler (damak genişleticiler) ile boyandı 3,4 BALIK floresan etiketli 16S kullanımı ile kendi ana biyofilm ortamında hücreleri leke için bir fırsat yaratır rRNA hedef sondalar. 4-7,19 immunofluorescent etiketleme gibi alternatif teknikler karşılaştırıldığında, bu karma biyofilm konsorsiyumların içinde farklı bakteriyel gruplar araştırmak için ucuz, hassas ve basit etiketleme tekniği. 18,20 Genel problar kullanıldı Öbakteriler bağlamak ( EUB338 + EUB338II + EUB338III bundan EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC; bundan LGCmix), 9,10 ve Bacteroidetes (Bac303) 11. Buna ek olarak, Streptococcus mutans bağlanarak spesifik problar (MUT590) 12,13 ve Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 . Katılan yüzey malzemeleri aşırı sertlik (paslanmaz çelik ve akrilik reçine), biyofilm hazırlanması için yeni yollar bulmak için bizi zorladı. Kriyotom ile bu yüzey malzemeleri kolaylıkla kesilebilir olamazdı olarak, sağlam sözlü biyofilm elde etmek için çeşitli örnekleme yöntemleri araştırıldı. Bu yaklaşımların en uygulanabilir, bu iletişimi sunulmaktadır. Biyofilm taşıyan akrilik reçine Küçük gevreği biyofilm yapısına zarar vermemeye dikkat ederek, steril bir bisturi ile kazınmış. Forseps çelik yüzeylerde biyofilm toplamak için kullanıldı. Bir kez toplanan numunelerin sabit ve polysine kaplı cam slaytlar doğrudan yerleştirildi. FISH probları m doğrudan bu slaytları yapıldıYukarıda entioned. Çeşitli BALIK protokolleri kombine ve kullanımı kolay yeni bir protokol oluşturmak için modifiye edilmiştir. 5,10,14,15 Daha sonra numuneler konfokal lazer tarama mikroskobu ile incelendi. Tanınmış yapılandırmaları 3,4,16,17 mantar tarzı oluşumlar ve kanallar tarafından kaplanır coccoid bakteri kümeleri dahil olmak üzere, görüntülenmiştir olabilir. Buna ek olarak, bu tipik biyofilm yapıların bakteriyel bir kompozisyon analiz ve 2D ve 3D görüntüler oluşturdu.

Ortodontik aletler doğal oral biyofilm yapısal ve kompozisyon analizi için bir protokol mevcut<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon (FISH) ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM). Oral biyofilm örnekleri kapalı akrilik reçine gevreği, yüzey kazıma ve moleküler işleme için onları yönlendiren, damak genişleticiler toplanmıştır.

Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi

Doğal heterojen biyofilmlerin konfokal lazer taramalı mikroskobu (CLSM), günümüzde kapsamlı bir boyama teknikleri yelpazesi ile kolaylaştırılmaktadır; bunlardan biri...

Bu prosedürün genel amacı, floresan yerinde hibridizasyon (FISH) için palatal genişleticilerden doğal oral biyofilm elde etmektir. Bu işlem, öncelikle palatal genişleticinin çıkarılmasıyla ve böylece hastanın dört aylık biyofilminin taşınmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, biyofilm içeren akrilik reçine pulları palatal genişleticiden kazınarak alınır.Ardından, sabitlenmiş biyofilmin C iki hibridizasyon floresansı doğrudan kaplanmış lamlar üzerinde gerçekleştirilir. Son olarak, boyanmış biyofilmin analizi konfokal lazer tarama mikroskopisi P kullanılarak yapılır. Sonuç olarak, bakteriyel biyofilm topluluklarının yapısı ve kompozisyonu, floresan in situ hibridizasyon ve konfokal lazer tarama mikroskopisi aracılığıyla gösterilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, ortodontik genişleticiler üzerinde çıplak gözle görülebilen kalın biyofilmlerle karşılaştığımızda edindik.Bunların periodontal hastalıklarla olası ilişkileri üzerine düşünmemizi sağladılar. Bu yöntem; yerli oral biyofilmlerin uzamsal düzenlemesi ve kompozisyonu gibi oral mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yöntem disiplinler arasıdır ve farklı uzmanlar tarafından yürütülmelidir.Başlangıç olarak, Elizabeth bir ortodontist ve Barbara ise bir moleküler laboratuvar biyologudur. NOLA kuru alan sistemini kullanarak, dört aylık ağız içi yüzey uygulaması sonrası, kontaminasyonu önlemek için sabit palatal genişleticiyi izole edin. Cihazı; sterilize edilmiş pense, eldivenler ve tepsiler kullanarak hastanın ağzından çıkarın.Nesneleri 120 mL'lik viallerde -20 °C'de saklayın. Laboratuvara buz üzerinde taşıyın ve örnekleri sabitlemek için 24 saat içinde işleyin. Biyofilm pullarını steril bir skalpel ile kazıyın veya steril penset ile parçalar toplayın.Biyofilm yapısının buz gibi soğukta bozulmadan kalmasını sağlamak için yeterli kalınlıkta akrilik reçine pullarının kazınması kritik önem taşır. Örnek iyice kaplanana kadar %4 paraldehit çözeltisi ekleyin. Karışımı dört derece Celsius'ta üç ila 12 saat boyunca inkübe edin.Daha uzun fiksasyon süreleri veya daha yüksek fiksasyon sıcaklıkları, gram-negatif hücrelerin hücre zarını oligonükleotid problarına karşı daha az geçirgen hale getirebilir. İnkübasyonun ardından, paraldehit çözeltisini uzaklaştırın ve buz gibi soğuk 1x PBS ile yıkayın. Kalan paraldehiti temizlemek için bu adımı iki ila üç kez tekrarlayın; numuneyi bir hacim buz gibi soğuk 1x PBS içinde askıya alın ve bir hacim buz gibi soğuk %96 etanol ekleyerek numuneyi -20 °C'de saklayın.Numuneleri dehidrate etmek amacıyla birkaç ay ile birkaç yıl arasında saklamak mümkündür. Öncelikle, 5 ila 30 µL paraldehitle fikse edilmiş numune materyalini bir mikroskop lamına uygulayın. Lizozim ve formaldehidin hücre duvarlarını kısmen parçalaması için numuneyi 46 °C'de 15 dakika veya oda sıcaklığında daha uzun süre kurutun.Probların daha iyi nüfuz etmesi için, 1 mg/mL'lik lizozim çözeltisinden 250 µL ekleyip oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından slaytları sırasıyla %50, %80 ve %96'lık etanol çözeltilerine üçer dakika boyunca daldırın. Etanol konsantrasyon serisinin dehidrasyon etkisi, oligonükleotid probların daha iyi alınması için membranları parçalayacaktır. Son olarak, in situ U hibridizasyonunu gerçekleştirmek için slaytları 46 °C'de kurutun.Bir mililitre taze hibridizasyon tamponu hazırlayarak işleme başlayın ve bunu 47 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun. Oligonükleotid Prob çözeltilerini buz üzerinde çözdürün ve ışıktan koruyun. Kare bir Petri kabına bir parça doku kağıdı yerleştirin ve doku kağıdının üzerine 800 µL hibridizasyon tamponu pipetleyin.Tampon formamid içerdiğinden hazneyi hemen tekrar kapatın, hibridizasyon tamponunun geri kalan 200 µL'sine her bir probdan iki µL ekleyin. İyice karıştırın ve karışımı mikroskop lamı üzerindeki dehidre edilmiş örneğe uygulayın; lamı hemen yatay olarak kaba yerleştirin ve kapağını kapatın. Kabı bir etüvde 46 °C'de bir ila beş saat inkübe edin.Kap, hibritleme solüsyonunun lamdan buharlaşmasını önleyen bir nem odası görevi görür. Özellikle formamid buharlaşması, probların hedef dışı hücrelere spesifik olmayan şekilde bağlanmasına neden olabilir. 50 mililitre yıkama tamponu hazırlayın ve bir benmari banyosunda 48 °C'ye kadar ön ısıtma yapın.Lamı içeren kabı hibridizasyon fırınından çıkarın. Hibridizasyon tamponunu, önceden ısıtılmış küçük bir hacim yıkama tamponu ile hemen yıkayarak uzaklaştırın ve lamı geri kalan yıkama tamponunun içine aktarın. Yıkama tamponunu ve lamı içeren tüpü tekrar su banyosuna yerleştirin ve 48 °C'de 10 ila 15 dakika inkübe edin.Numuneleri birden fazla prob ile boyamak için, yıkama tamponu uzaklaştırıldıktan sonra önceki adımları tekrarlayın; işlemlere en yüksek konsantrasyondan başlayıp düşük konsantrasyona doğru ilerlediğinizden emin olun. Lamı tüpten çıkarın ve buzlu suya daldırın.İki ila üç saniye boyunca soğuk çift distile su ile yıkayın. Kalan yıkama tamponunu gidermek için lamı mümkün olduğunca hızlı bir şekilde havada kurutun; hızlı kurutma, prob disosiyasyonunu azaltır.Kurutulmuş lamları, probun sağladığı floresan sinyalinde herhangi bir önemli kayıp olmaksızın birkaç hafta boyunca karanlıkta -20 °C'de saklayın. Numuneleri görüntülemek için, bir lamın sol ve sağ uçlarına yakın bölgelere iki damla Antifa reaktifi uygulayın ve ardından bir lamel ekleyin. Numuneleri uygun filtreler veya lazerlerle donatılmış konfokal lazer taramalı mikroskop altında inceleyin; lamlar 4 °C'de yedi güne kadar saklanabilir veya çift distile su ile yıkanıp daha uzun süreler boyunca -20 °C'de saklanabilir.Sabit ortodontik apareylerin biyofilmi görüntülenmektedir. Mikroskopi için kaplamalı cam lamlar üzerinde doğrudan hibridize edilebilen uygun parçalar elde edilebilir; böylece farklı oral mikrobiyom grupları ve üç boyutlu konfigürasyondaki bakteriler spesifik problar aracılığıyla tanımlanabilir. Bu şekilde, biyofilm EUB karışımı ile boyanmış olup yeşil görünmektedir; LGC karışımı ile boyananlar ise sarı ve mavi görünmektedir.Burada biyofilm, EUB mix back 3 0 3 ve pogi ile boyanmıştır. Bacteria dts grubu bakterileri pembe ve zayıf kırmızı renkte görünmektedir. Ramons gingivalis, üç probun da DNA'sına bağlanması ve renklerin üst üste binmesi sonucunda beyaz bir sinyal oluşturması nedeniyle sarımsı beyaz renkte gösterilmiştir. Morfolojik.Bakteri grupları arasındaki farkların yanı sıra, kok bakterilerin oluşturduğu büyük kümeler gibi belirli yapılar da tanımlanabilir. Boyama için EUB mix kullanılan bu tür kümelere örnekler burada gösterilmiştir. Ayrıca, biyofilmin tipik mantar benzeri yapısı, CLSM verilerinin 3 boyutlu modellenmesi yoluyla işlenebilir.Bu, EUB karışık boyanmış biyofilmin 3D animasyonudur. Bu yöntem, ortodontik olarak indüklenen biyofilm oluşumu hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, insan vücudunda olası patojeniteye sahip karmaşık biyofilm yapıları taşıyan diğer tüm yapay yüzeylere de uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, doğal oral biyofilmlerin floresan in situ hibridizasyon ve konfokal lazer taramalı mikroskopi için nasıl hazırlandığı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bunun disiplinler arası bir alan olduğunu ve ancak bir ekip içinde başarılı olabileceğinizi unutmamak önemlidir. Bu nedenle iş arkadaşlarınızla her zaman nazik bir şekilde etkileşim kurun.

oral-biofilm-analysis-palatal-expanders-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Diş yüzeylerinde oluşan Biyofilmler, son derece karmaşık ve kendi mimari modüle doğuştan sabit ve dışsal çevre sorunlarına, fizyoloji ve transcriptome maruz. Bileşimi, yapısal organizasyon ve oral biyofilmlerin biyofilm araştırmanın diğer alanlara adapte olabilen gen ekspresyonu, incelemek için bir araç kutusu geliştirdi.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Bu video, pH'a duyarlı bir oransal prob kullanılarak dental biyofilmlerde hücre dışı pH'ı izlemek için gerçek zamanlı bir testi göstermektedir. Yerinde yetiştirilen bir bakteri biyofilmi glikoza maruz kaldığında, bakteriyel biyokütlenin yakınındaki hücre dışı pH'daki bir azalma probu protonlar protonlar ve bakteri içindeki konsantrasyonunun artmasına neden olur. Protonlanmış ve protonlanmamış prob arasındaki emisyon dalga boyundaki eşitsizlik, biyofilmin hücre dışı matrisi boyunca pH'ı...

Dental Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın Gerçek Zamanlı İzlenmesi için Bir Test

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Bir pH-duyarlı rasyometrik boya gerçek zamanlı olarak diş biyofilmlere ekstrasellüler pH izleme konfokal lazer tarama mikroskobu ve dijital görüntü analizi ile kombinasyon halinde kullanılır.

Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Çocukluk boyunca oral microbiome ilgi büyüyen değişikliklerdir. Farklı microbiome çalışmalar karşılaştırılması Standart örnekleme iletişim kurallarının eksikliği ortaya koymaktadır. Sınırlı alanlarda çocukların zorlu ses subgingival sulkus örnekleme yapar. Kağıt noktası örnekleme yönteminin seçimi için bu alanı olarak ayrıntılı olarak burada sunulur.

Sağlıklı çocuklarda Microbiome analiz için sözlü biyofilm örnekleme

Burada, sözlü biyofilm oluşumu için diş protez ayakları bakteri hücreleri canlılığı ve morfolojik özellikleri analizi de dahil olmak üzere, titanyum ve zirkon malzemeler üzerinde değerlendirmek için bir protokol mevcut. Güçlü mikroskobu teknikleri ile ilişkili bir in situ modeli sözlü biyofilm analizi için kullanılır.

Diş implantları için farklı malzemeler üzerinde sözlü biyofilm oluşumu

Protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin ekimini açıklar ve bu biyofilmlerin içinde hücre dışı pH'ın izlenmesi için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem sunar.

Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın izlenmesi

Bu çalışma, ağız içi floresan kamera ile elde edilen görüntülere dayanarak açıklanan diş plağının planimetrik ölçümü için yarı otomatik bir dijital görüntü analizi prosedürü sunmaktadır. Yöntem, araştırma ortamında diş plağının hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Ağız İçi Floresan Kamera Kullanılarak Diş Plakının Yarı Otomatik Planimetrik Ölçümü

Bu protokolün amacı, fırın diş eti epitel bariyerinin bütünlüğünü nicel olarak değerlendirmek için standart bir yaklaşım sağlamaktır; diş eti yüzeyine farklı moleküler boyutlarda floresans etiketli dekstransları in vivo uygulanarak ve ardından tek foton mikroskopi sistemiyle ex vivo görüntüleme uygulanır.

Fusesans İzleyicilerle Fare Diş Etili Epitelyal Bariyerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

Öğrenin, palatal genişleticilerden oral biyofilm örneklerini FISH ve CLSM teknikleriyle analiz etmeyi. Bu yöntem, bakteri topluluklarının yapısal ve bileşimsel analizini sağlar.

Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi

Daha fazla video keşfet