Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

Bu prosedürün genel amacı, hücre içi kalsiyum değişikliklerinin optik görüntülenmesi ile drosophila ve anten lobundaki koku alma nöronlarının fizyolojik aktivitesini ölçmektir. Bu, önce montaj bloğunun, tel tutucunun ve anten kalkanının monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, floresan kalsiyum sensörü GCaMP'yi ifade eden bir sinek monte edilir ve bloğa sabitlenir.

Sinek monte edildikten sonra, anten loblarını ortaya çıkarmak için sinek kafasının üstündeki kütikül kesilir. İşlemin son adımı, sineği mikroskop altına koymak ve bir koku ile uyarmaktır. Sonuç olarak, kalsiyum sensörü G kampının nispi floresansında kaydedilen değişiklikler yoluyla DLA anten loblarında koku ile uyarılan aktivite modellerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu Yöntem, kokuların koku alma devresinin farklı seviyelerinde mekansal ve zamansal nöral aktivite kalıpları olarak nasıl temsil edildiğini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin elektrofizyoloji gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, elektrotları kaydetmek için erişilemeyen genetik olarak tanımlanmış nöronların aktivitesini kaydedebilmemizdir. Bu yöntem, kokuların sinirsel olarak işlenmesi hakkında bilgi sağlayabilir.

Ayrıca, işitsel ve gazlı sistemler gibi joof beyninin diğer bölgelerine de uygulanabilir. İlk olarak, vidaları pleksiglas montaj bloğunun arkasından, ön tarafın dışına taşmayacak şekilde geçirin. Bloğun kalınlığını azaltmak için yüzeyin altını kazarak sinek için dairesel odanın üst sınırında bir çukur oluşturmak için hassas bir matkap kullanın.

Bir diseksiyon dürbünü altında, sineği tutmak için bir yaka oluşturmak için yarığın dibine dik ve yakın bir neşter ile bakır bir ızgara kesin. Ortaya çıkan iki kanadın düz olduğundan emin olun, çünkü bu, sineğin yerleştirilmesine yardımcı olacaktır. Bir kürdan ile dairesel haznenin üzerindeki montaj bloğuna küçük bir damla süper yapıştırıcı damlatın.

Sinek için, bakır ızgarayı tutkalın üzerine yerleştirin ve yarık blok üzerinde ortalanacak şekilde konumlandırın. Izgaraya hafifçe bastırın ve fazla yapıştırıcıyı bir cımbızla çıkarın. Her iki taraftaki kanatların altına küçük tutkal damlaları ekleyin ve ızgarayı, yarık düz bir şekilde aşağıya bakacak şekilde bloğun ön tarafına katlayın.

Izgaranın üst kısmının blokla aynı hizada olduğundan emin olun ve tamamen kurumasını bekleyin. Bir tel tutucu yapmak için, plastik bir kapak kızağını ikiye bölün ve U şekli yapmak için merkezi bir parçayı çıkarın. Telin çok t olmaması için U'nun üstüne bir parça tel yapıştırmak için balmumu kullanın.

Plastik bir kapak kızağında bir delik açmak için bir kağıt deliği zımbası kullanarak bir anten kalkanı oluşturun. Kapak kaymasının kenarlarını 0,5 x 0,7 santimetre kesin. Delinmiş plastik kapak kayışını yapışkan bant üzerine yapıştırın ve ardından delikten açıkta kalan bandın üzerine bir damla etanol koyun.

Yapıştırıcıyı çıkarmak için, uygun genotipteki bir ila üç haftalık sinekleri buz üzerinde soğutarak anestezik hale getirin. Diseksiyon kapsamı altında, kanat ekleminden bir sinek alın ve önce sırt yüzeyini bakır ızgara boyunca kaydırın, böylece boyun tarafından asılır. Gerekirse, sineği aşağı bakana kadar döndürün.

Kaçmasını önlemek için sineğin başının önüne ince bir kaktüs omurgası yerleştirin ve hareket etmesini önlemek için omurgayı proboların önüne yerleştirin. Kaktüs omurgasını balmumu kullanarak bloğa sabitleyin, başın üst kısmının bloğun üst kısmı ile aynı seviyede olduğundan emin olun. Sineğin başını etanol içinde çözülmüş küçük bir damla reçine ile bloğa sabitleyin.

Bloğu nemlendirilmiş bir kutuya yerleştirin ve reçinenin yaklaşık bir saat sertleşmesine izin verin. Forseps kullanarak anten plakasını öne doğru çekin ve tel tutucuyu anten ile kafa arasındaki kütiküler kıvrıma bırakın. Tutucuyu daha fazla balmumu ile bloğun önüne sabitleyin.

Bloğun içine yerleştirilmiş vidaları kullanarak, anten plakası ile kafa arasında biraz boşluk oluşturmak için tel tutucuyu yavaşça ileri doğru itin. Anten kalkanını, tamamı merkezi olarak konumlandırılmış şekilde bir sineğin başının üstüne yerleştirin. Kalkanı balmumu ile montaj bloğunun üstüne sabitleyin.

Bir bıçak ayırıcı kullanarak, kalkan üzerindeki bantta küçük bir delik açın ve antenin arkasındaki sinek kafasının kütikülünü açığa çıkarın. Preparatın sızmasını önlemek için delik gözlerin ötesine uzanmamalıdır. Bant ile kütikül arasındaki deliği iki bileşenli silikonla kapatın.

Sinek kafasının üst kısmındaki fazla silikonu çıkarın. Sineğin kafasına bir damla drosophila zil tuzu damlatın, sızıntı olmadığından ve antenin tamamen kuru kaldığından emin olun. Safir bir bıçak kullanarak, doğrudan antenin arkasındaki kütiküler kıvrım boyunca hafifçe puan alın.

Sonra gözleri ve arkadaki selli'yi kesin. Son olarak, kütikül parçasını çentikli kenarın üzerine katlayın ve alttan kesin. Anten sinirlerinin kopmasını önlemek için, bezleri ve trakeayı ince cımbızla dikkatlice çıkarın.

Drosophila zil çözeltisi ile tekrar tekrar durulayın ve kafada büyük bir damla bırakın. Temiz forsepsli iki mililitrelik plastik bir şırıngaya bir selüloz ped yerleştirin. Filtrelenmiş bir pipet ucu kullanarak 20 mikrolitre seyreltilmiş koku maddesi uygulayın.

Görüntüleme için gerekli olana kadar şırıngayı takın ve kapatın. Sineği içeren montajı mikroskop altına yerleştirin. Hedefi, sineğin kafasındaki zil çözeltisine değene kadar indirin.

Parlak alan aydınlatması altında izleyiciden bakarken, hazırlığı, kafa kapsülündeki delik ortalanacak ve sınırları odakta olacak şekilde konumlandırın. Floresan ışığa geçin ve GCaMP'nin bazal yeşil floresansından görülebilmesi gereken etiketli nöronları görene kadar odağı ayarlayın. Uygun toplama yazılımı kullanarak mikroskoba monte edilmiş bir CCD kamera ile görüntüler elde edin ve ilgilenilen glomerüllere odaklanın.

Uyarma ışığını görüntülenen alanla sınırlamak için aydınlatma ışığı yolundaki diyaframı kapattığınızdan emin olun. Olfaktometrenin çıkışını sinek antenlerinin yaklaşık 0,5 santimetre önüne yerleştirin. Burada, anal loblar, %1 propiyonik asit ile birkaç glomerül stimülasyonunda ekspresyonu yönlendiren bir koku alma duyusal nöron promotörü kontrolü altında GCaMP 1.6'yı eksprese eden bir sinekte gösterilmiştir, hücre içi kalsiyumda artışları gösteren GAMP floresansında artışları ortaya çıkarır, koku alma duyu nöronlarında, innerve glomerüllerde, DC dört ve DP bir L'de propiyonik aside kalsiyum tepkilerinin zamansal dinamikleri burada gösterilmiştir.

Siyah izler, sekiz hayvanın ilgilendiği bölge içinde F üzerindeki ortalama delta F'nin medyanını gösterir ve gri yüzey, dağılımın birinci ve üçüncü çeyreği arasındaki aralığı gösterir. Aşağıdaki ısı haritaları, tek tek hayvanların tepkilerini göstermektedir. Yeşil macenta kutular, glomerüllerin GCaMP'nin temel floresan seviyelerinin üzerindeki tepe tepkilerini hesaplamak için ortalaması alınan kareleri gösterir ve burada niceliksel olarak gösterilir.

Floresan raportörün ağartılmasının düzeltilmesinin yanıt üzerinde etkileri olabilir. Sol paneldeki tepe örnek verileri, yanıtın şeklinde büyük değişiklikler olmadan düzeltilebilir. Örnek. Sağ paneldeki veriler, muhtemelen sinyalin düşmesi ve koku uyaranının sonlandırılmasından sonra taban çizgisinin altında tutulması nedeniyle, ağartıcı düzeltmesinden ciddi şekilde etkilenir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık 30 dakika içinde yapılabilir.

Doğru şekilde yapılırsa Bu prosedürü denerken, anteni tamamen kuru tutmak önemlidir, aksi takdirde kokuları algılayamazlar. Bu videoyu izledikten sonra. Görüntünün nasıl hazırlanacağı ve kokunun nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Meyve sineğinde nöronal aktiviteyi uyandırır.