Name: Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Keşfedin fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri izolasyonunu perikardiyal yıkama yöntemiyle. Bu teknik, enzimatik sindirimin neden olduğu istenmeyen hücre aktivasyonunu önleyerek kalp bağışıklık hücrelerinin işlevselliğini korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma bir UNCF-Merck Lisansüstü Bilim Araştırma Tezi Bursu (JLM), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe RO1-HL-62.228 (JSJ) ve RO1-HL-073.990 (JSJ) tarafından desteklenmiştir.

1. Hanks 'Balance Tuz Çözeltisi Hazırlama (HBSS) <ol><li> Otoklav 1 L cam beher, 1000 mL dereceli silindir, ve bar karıştırın. </li><li> Çift distile su ile 900 mL işaretine otoklavlanmış 1 L cam beher HBSS toz çözüm sulandırın. </li><li> HBSS çözüm 3.4 g HEPES Na + tuz ile karıştırın ve 7,35-7,41 arasında bir değer ya da konsantre HCL veya NaOH kullanılarak pH ayarlamak. </li><li> Istenilen pH elde ve sabit kalır sonra 5 g, albümin, tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında çözüm sığır albümin serum ekleyin. </li><li> Toplam hacmi 1000 ml işaretine kadar çözüm antimyotic, antibiyotik ve çift distile su 10 ml ekleyin. </li><li> Çözümü iyice karıştırın. </li><li> HBSS çözüm Filtre ve daha sonra kullanmak için 50 ml Falcon tüp içine ayrı. Ek tüpler dondurulmuş ve sonraki bir tarihte kullanılabilir. </li></ol> 2. Hayvan preparatlarn - Trakeal Tüp yerleştirilmesi <ol><li> (Yani forseps, makas, trakeal tüp, 3-0 siyah örgülü sütür, küçük hayvan vantilatör vb) bir trakeal tüp yerleştirilmesi için gerekli aletler ve malzeme ile bir tepsi hazırlayın. </li><li> Sıçan oranı 1 ksilizin 2 ketamin ketamin / xylazine bir kokteyl ile tamamen uyuşturulduktan sonra, sıçan, karın, göğüs ve boğaz tıraş. Derin bir anestezi devleti elde edildiğine emin olmak için, farenin ayak tutam ve ekstremitenin pedal çekilmesi için kontrol edin. Sıçan bütün kesiler yapmadan önce derin anestezi olduğundan emin olun. </li><li> 30 ° açıyla eğimli bir kesme tahtası üzerinde kaldırdı başını sıçan yerleştirin </li><li> Orta-karın alt çene altına bir cilt insizyonu olun. Trakea ortaya çıkarmak için boynun ön üçgen kasları parçalara ayır. </li><li> Trakea altında 3-0 siyah örgülü sütür yerleştirin. </li><li> Trakea kıkırdak halkaları arasında bir kesi olun.d trakeal tüp yerleştirin. Trakeal tüp trakea güvenli dikiş sıkıca bağlayın. </li><li> Küçük bir hayvan ventilatöre trakeal tüp bağlayın. </li></ol> 3. Bağışıklık Hücre İzolasyon Aracı Hazırlama <ol><li> Bağışıklık hücre izolasyon işlemi için araçların (forseps, makas, HBSS, iğne hızlı cath üzerinde yumuşak teflon 24 gauge Baxter intravasküler kesilmiş) ile bir tepsi hazırlayın </li><li> İki 10cc şırınga hazırlayın, HBSS içeren hücreleri aspire perikardiyal kese ve yedek diğeri içine tampon tanıtmak için bir şırınga HBSS doldurun. 3.2.1. Izolasyon prosedürü için orijinal uzunluğunun 1 / 2 3 / 4 iğne hızlı cath (1.6 cm) üzerinden 24 gauge Baxter intravasküler teflon ucu azaltın. </li><li> Tüm şırıngalar, tamponlar ve boş bir 15 ml Falcon Tüp (prosedür tamamlandıktan sonra çıkarılan sıvı tutmak için) buz üzerinde yerleştirin. </li></ol> &lt;p class = "jove_title"&gt; 4. Bağışıklık Hücre İzolasyonu <ol><li> Kılıç şeklinde bir süreç ulaşana kadar orta hat karın duvarı linea alba boyunca bir kesi yapmak. </li><li> Biraz yanal kılıç şeklinde bir süreç başlayarak, aksilla doğru bir açıyla devam eden göğüs kafesi ile ikili kesiler yapmak. Akciğerler, kalp, perikard ya da perfore için dikkatli olun. </li><li> Sternumun her iki tarafta insizyon tamamlandıktan sonra, mediale yanal kesme, alt kaburga diyafram uzak teşrih. Not: perikard diyafram ve zarar görmemesi için sternum bağlanır hiç farkında olun. Orak şeklinde ligaman perikard karşı tarafında diyaframın bağlı olduğu notu için bir dönüm noktası olarak kullanın. Ayrıca, perikard kesilir, hücreleri izole etme yeteneğini kaybetti. </li><li> , Göğüs boşluğu ve kalp (hala perikard kapsüllenir) maruz göğüs kafesi bir tarafı hafifçe kaldırın.</li><li> HBSS şırınga alın ve sternum ve kalp (tercihen daha fazla rostral kaudal daha) arasında yaklaşık yarım perikard kesesi içinde bir nokta bulmak ve teflon ucu takın perikard her iki katmanları ile hızlı cath kısaltılabilir. </li><li> Kateter yerleştirildikten sonra, 2 ila 3 ml HBBS tampon ile perikard boşluğu doldurmak hafifçe geçin. Perikardiyal alanı genişleyen gördüğünüzde kateter yerleştirilir hemen bilecektir. Dolum tanık ise, çekilme ve hızlı cath yeniden konumlandırmak. </li><li> Perikard kesesi dolu olduğunda, diğer 10 cc şırınga ve perikard ucu yerleştirin ve tampon aspire başlar. Aynı giriş deliği kullanılabilir ya da başka bir oluşturulabilir. Özellikle kalbin alt sağlarken, emme ucu perikardiyal kese duvarları çok yakın gelmiyor emin olun. Bu perikardiyal kese ve hücre içeren hücre kaybı delinmesiyle yol açabilirs </li><li> Tampon aspire ederken, kateter ucu mümkün olduğunca tampon toplamak için perikardiyal kese içinde dolaştı olabilir. </li></ol> Not: Bunu yaparken biraz perikard yırtılma ve orijinal bir delik daha büyük kalp üstündeki delik, panik yapmayın . Perikard sürece hala yeterince kalp çevreleyen tampon daha az miktarda da olsa kalp üzerinde hala başka bir yıkama gerçekleştirebilirsiniz. Optimal miktarda hücre toplama, 03:57 ek yıkar ihtiyaç vardır. <ol start="9"><li> Ayıklanan tampon buz üzerine yerleştirildi Falcon tüpler içine yerleştirin. </li><li> Kalp, akciğerler ve / veya daha ileri çalışmalar için gerekli olan diğer doku varsa çıkarın. Bağışıklık hücreleri ve diğer dokulara toplandıktan sonra, sıçan, hızlı ve insanca ötenazi olmalıdır. </li><li> 4 200g az 10 dakika ° C için toplanan bağışıklık hücre örnekleri Santrifüj Tüpler her zaman buz üzerinde tutmakKullanılmadığı zaman. </li><li> Hyclone Tampon veya HBSS 1 mL supernatant ve sulandırmak pelet çıkarın. </li></ol> Not: bağışıklık hücre izolasyon prosedürü sonra her kalp elde edilen bağışıklık hücrelerinin sayısını çok önemlidir. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bu toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi ve vitray tekniği ile elde edilen izole kardiyak mast hücreleri bir örnek, 2A ve 2B rakamlar sırasıyla sunulmuştur. Şekil 3, kalp direk görülebileceği gibi, Morgan ve ark açıklandığı gibi bileşik 48/80 ve P maddesi olarak bilinen aktivatörleri ile tedaviden sonra histamin salınımı yeteneğini sürdürdü. CD4 flow sitometri 9 Temsilcisi dağılım araziler + hücreleri ve sırasıyla Şekil 4 ve 5, CD8 + hücreleri sunulmaktadır. T-lenfositler daha da tanımlanır ve bu tekniğin bir hücre popülasyonu olarak phenotyped. Kalp bağışıklık hücre izolasyon prosedürü Şekil 1. Akış şeması. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg"> Şekil 2 kalp mast hücrelerinin histolojik temsilcisi görüntüleri aşağıdaki gibi lekeli: (A) (B) toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg"> Şekil 3 epikardiyal miyokard bölgeden izole edilmiş ve bileşik 48/80 (10μg/mL) ve P maddesi (10μM) ile uyarılan kalp mast hücreleri fonksiyonel çalışma. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg"> Şekil 4 izole CD4 + hücreler, P maddesi (1:100 dilut ile etiketlenen Temsilcisi flow sitometri dağılım arazileriyon). <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg"> Şekil 5, P maddesi (1:100 dilüsyon) ile etiketlenmiş izole CD8 + hücreleri Temsilcisi flow sitometri .

<ol><li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li>
<li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li>
<li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li>
<li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li>
<li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li>
<li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cells%3A+Versatile+regulator+of+inflammation%2C+tissue+remodeling%2C+host+defense+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li>
<li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li>
<li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-%C9%91+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-%C9%91%2C+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li>
<li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li>
<li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li>
<li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li>
<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Kardiyak bağışıklık hücrelerini izole Bu yöntem genellikle enzimatik sindirimi geleneksel bir izolasyon tekniği sırasında ortaya çıkan istenmeyen aktivasyon olmadan bunların fonksiyonları, fenotip ve olgunluk analizi sağlar. Bu tekniği ile elde edilen hücrelerin ortalama toplam sayısı sıçan kalbinde başına 400.000 civarındadır ve bu hücrelerin diferansiyel boyama ve flow sitometri analizi, T-lenfositler (~% 70), makrofajlar (~% 12) ve mast hücreleri ile karışık bir nüfus olduğunu gösterir Bu tekniğin kullanılması (~% 12...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Tom Hanks &#39;Dengeli Tuz </td><td> Sigma </td><td> H4891 </td><td> Bir şişe Hanks &#39;Denge Tuz 1 L yapar Çözümü. Sulandırın Hanks &#39;Denge Tuz Çözüm prosedürünün bir parçası olarak. </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> 250 ml Nalogene Filtre Şişe </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> 6 N HCL eşit hacimlerde eklemek, deiyonizesu. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> Fisher Scientific </td><td> SC267 </td><td> 5 N için eşit miktarda NaOH, deiyonize su ekleyin. </td></tr><tr><td> Çift Distile Su </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Özel Ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 3-O Sütur İpek Örgülü </td><td> Ethicon Ürünler </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> Küçük Hayvan Vantilatör </td><td> CWE Incorporated </td><td> SAR-830 </td><td> Solunum hızı dakikada 40,5 nefes ayarlayın. </td></tr><tr><td> Konik 18 iğne </td><td> BD Biosciences </td><td> 305199 </td><td> Trakeal tüp olarak kullanmak için kendi orijinal boyunun 1 / 2 3 / 4 iğne kesin. </td></tr><tr><td> 24-gauge Baxter hızlı cath kateter Teflon İpucu (iğne kaldırıldı) </td><td> Baxter </td><td> 2N111 </td><td> 1 / 2 3 / 4 Teflon İpucu süresini azaltın. </td></tr><tr><td> 10 cc şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-823-16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Falcon Tüpleri </td><td> BD Biosciences </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B Soğutmalı Santrifüj </td><td> Fisher Scientific </td><td> 75-004-377 </td><td> Ön-cool unutmayın ve 4 ° C </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> HS-LB-1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri İzolasyon

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Kardiyak bağışıklık hücreleri, birçok kalp hastalıkları patolojik remodeling oynadıkları roller için faiz kazanıyor mast hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar 1-5 Bu bağışıklık hücreleri, depo ve sitokinler ve dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak aktif mediatörlerin serbest triptaz olarak proteazlar 6-8 Bu aracılar, ekstraselüler matriks metabolizmasında anahtar oyuncular matriks metalloproteinazların aktive veya modüle kardiyak fibroblastlar &#39;fonksiyonu kollajen birikimi neden olduğu gösterilmiştir. 9-11 Bununla birlikte, kardiyak bağışıklık hücrelerini izole etmek için uygun teknikler var miyokard doku sindirimi bakteriyel kollajenaz kullanımı nedeniyle sorunlu olmuştur. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve böylece fonksiyon kaybına neden olur. Örneğin, kalp mast hücrelerinin degranülasyonu neden olan bileşiklerin önemli ölçüde daha az duyarlı hale gelir. 12 Bu nedenle, biz t sağlayan bir teknik geliştirdikalp hastalığı bu hücrelerin rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücrelerinin izolasyonu 13, 14 Bu yöntem, kalbin anatomik sıçan kılıç şeklinde süreci, koltuk altı ve orak şeklinde ligaman konumu ve perikard ile bir aşinalık gerektirir. Bu simge prosedürün başarısını artırmak ve kalp bağışıklık hücrelerini daha yüksek bir verim sağlamak için önemlidir. Bu izole kardiyak bağışıklık hücrelerini sonra, fenotip, olgunluk, ve diğer kalp hücreleri ile ko-kültür deneyler, bunların karşılıklı etkileşimi daha iyi bir anlayış kazanmak için karakterizasyonu için kullanılabilir.

Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Kardiyak immün hücreler, birçok kalp hastalığındaki patolojik yeniden şekillenmede oynadıkları roller nedeniyle ilgi görmektedir.1-5 Bu immün hücreler...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel kardiyak immün hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle sıçanın ventile edilmesi ve kalbi çevreleyen perikardiyal kesenin açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, perikardiyal boşluğa Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS enjekte edilir.Ardından, artık perikardiyal boşluktan gelen bağışıklık hücrelerini içeren HBSS aspire edilir. Son olarak, izolasyon prosedüründen elde edilen bağışıklık hücrelerinin sayısı belirlenir. Nihayetinde, kardiyak bağışıklık hücrelerinin fonksiyonelliğini ve biyolojik aktivitesini değerlendirmek için hücrelerin kimyasal degranülasyonu veya ko-kültür deneyleri, akış sitometrisi, immünofloresan analiz veya farmakolojik tedavileri uygulanabilir.Bu prosedürü laboratuvarımdan üç kişi uygulamalı olarak gösterecektir. Lisansüstü öğrencisi Jennifer McLarty, doktora sonrası araştırmacı Giselle Melendez ve baş teknisyenim Spencer. Bu tekniğin, örneğin kolajen sindirim gibi mevcut bağışıklık hücresi izolasyon yöntemlerine göre temel avantajı, istenmeyen bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve hasarını önlemesi ve bağışıklık hücrelerinin deneysel tedaviye karşı tepkisini korumasıdır. Başlamadan önce, bir kesme tahtasını 30 derecelik bir açıyla eğin.Ardından, 18 gauge bevel iğnenin ucunun yarısını veya dörtte üçünü kesmek için bir Dremmel elektrikli aleti kullanın. Sıçan izlendiğinde endotrakeal tüp kullanımı için daha kısa bir uç oluşturun. Yeterli anesteziyi sağlamak için hayvanın karnını, göğsünü ve boğazını tıraş edin, ardından karnın ortasından çenenin altına kadar cilt kesisi yapın.Ardından, trakeayı açığa çıkarmak için boynun ön üçgenindeki kasları disseke edin; trakea ortaya çıktığında, altına 3-0 siyah örgülü sütür yerleştirin. Şimdi, kıkırdak halkalar arasından trakeaya bir insizyon yapın ve trakeal tüpü yerleştirin. Trakeal tüpü sabitlemek için 3-0 sütürü trakeanın etrafında sıkıca bağlayın.Ardından, endotrakeal tüpü küçük hayvan ventilatörüne bağlayın ve solunumu başlatın. Kalbin ve akciğerlerin yeterince oksijenlendiğinden emin olmak için, ventilatörün inspirasyon ve ekspirasyon evreleri sırasında sıçanın göğüs kafesinin sırasıyla eşit şekilde yükselip alçaldığını onaylayın. İmmün hücre izolasyonuna başlamadan önce, 10 cc'lik bir şırıngayı HBSS ile doldurun.Ardından, izolasyon prosedürü için daha kısa bir uç oluşturmak amacıyla, 24 gauge Baxter intravasküler iğne üzeri kateterin yumuşak Teflon ucunun son kısmının yarısını veya dörtte üçünü kesin. 24 gauge Baxter intravasküler iğne üzerini yerleştirin.HBSS içeren şırıngaya kateter ucunu hızla takın. Ardından HBSS dolu şırıngayı, tüm tamponları ve boş bir 50 mililitre konik tüpü buza yerleştirin. Şimdi, linea alba'dan xifoid çıkıntıya kadar abdominal duvara orta hat kesisi yapın.Ardından, ksifoid çıkıntının hemen yanından başlayarak, göğüs kafesi boyunca bilateral insizyonlar yapın. Akciğerleri, kalbi veya perikardiyumu yaralamamaya dikkat ederek aksilla yönünde bir açıyla devam edin. Daha sonra, lateralden mediale doğru keserek diyaframı alt kaburgalardan ayırın.Ardından, diyaframın karşı tarafında perikardın nerede bağlandığını belirlemek için falciform ligamenti bir işaret olarak kullanın. Torasik boşluğu ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesinin bir tarafını nazikçe kaldırın. HBSS ve hücreleri aspire ederek perikardal ponksiyonu gerçekleştirin ve iğneyi yeniden yerleştirin.Şırıngalar, prosedürün en zor kısımlarıdır. Perikardı hafifçe yırtarsanız panik yapmayın. Perikard, kalbin çevresini sararak onun etrafında kase benzeri bir yapı oluşturacak kadar bütün kaldığı sürece, kalp üzerinde yıkama işlemlerini gerçekleştirmeye devam edebilirsiniz.Sternum ile kalp arasında yaklaşık olarak orta noktada, tercihen kordal bölgeden ziyade daha rostral bir nokta seçin ve hızlı kateterin Teflon ucunu perikardın her iki tabakasından geçirin. Uç yerleştiğinde, perikardiyal boşluğu nazikçe iki ila üç mililitre HBSS ile doldurun. Kese dolduğunda, ucu boş 10 cc'lik şırıngaya aktarın ve ucu tekrar perikardiyal boşluğa yerleştirin.Aynı giriş deliğini kullanarak, vakumlama işlemi sırasında pipet ucunun perikardyal kesenin duvarlarına, özellikle de kalbin alt kısmına çok fazla yaklaşmadığından emin olarak tampon çözeltiyi mümkün olduğunca aspire edin. Ardından, sıvı ekstraksiyonu sonrası tamponu 15 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü dört derece Celsius'ta tutarak perikardyal keseyi iki ila üç mililitre daha HBSS ile doldurup boşaltın.Kurtarılan HBSS yaklaşık üç ila dört kez daha 15 mililitrelik tüpe aktarılır. Her yıkamanın ardından kalp, akciğerler ve/veya diğer çalışmalar için gerekli olan diğer dokular çıkarılır. Tüpler buz üzerinde tutulur.Kullanılmadığı zamanlarda, toplanan immün hücre örneklerini 200 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. 4 °C'de süpernatantı uzaklaştırın ve ardından peleti, gösterilen 1 mL HBSS içinde yeniden süspande edin.Kardiyak immün hücre izolasyonu sonrası hücre morfolojisini ve olgunluğunu belirlemek için yapılan histolojik çalışma örnekleri burada sunulmuştur. Toluidine blue, AUM blue ve seranin O ile boyanmış kardiyak mast hücreleri sırasıyla solda ve sağda gösterilmektedir. Burada, kalbin epikardiyal bölgesinden izole edilen kardiyak mast hücrelerinin bilinen aktivatörlerle stimüle edildiği bir fonksiyonel çalışmanın sonuçları gösterilmiştir.İzole edilen kardiyak mast hücreleri, mililitre başına 10 mikrogram bileşik 48 80 veya 10 mikromolar substans P ile tedavi edildiklerinde histamin salgılama yeteneklerini korurlar. Sonraki iki şekilde, izole edilmiş kardiyak bağışıklık hücrelerinin akış sitometrik analizinden elde edilen temsili dağılım grafikleri gösterilmiştir; ilk dağılım grafiğinde perikardiyal izolat içerisinde CD4 pozitif T hücreleri tanımlanmıştır. İkinci dağılım grafiğinde ise CD8 pozitif T hücreleri tespit edilmiştir. Bu prosedür uygulanırken, tampon çözelti enjekte edilirken ve bağışıklık hücrelerini içeren tampon çözelti aspire edilirken perikardiyumun bütünlüğünü korumanın önemli olduğunu unutmayın; bu, elde edilen hücre verimini artıracaktır.

isolation-of-functional-cardiac-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Bu iletişim kuralı izole, tanımlamak ve kararlı duruma veya enflamasyon sırasında fareler Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri ölçmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyor. Protokol enzimatik ve mekanik sindirim daha fazla akış sitometresi tarafından analiz edilecek bir tek hücre süspansiyon nesil için birleştirir.

Yalıtım ve kalp Extravascular bağışıklık hücreleri tanımlaması

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Temel araştırma ve biyoloji ve tedavi potansiyelini araştırmak için murine kardiyak perisitleri izole etmek ve arındırmak için bir protokol optimize ettik.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Burada sunulan enzimatik sindirim yoluyla tek bir hücre süspansiyon hazırlayarak makrofajlar ve diğer bağışıklık dışı hücrelerin çeşitli alt kümeleri insan ve fare miyokardiyum izole etmek için bir protokoldür. Akış sitometrisine dayalı tanımlama ve izole makrofajların karakterizasyonu için gating şemaları da sunulmuştur.

Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon

Bu çalışmanın amacı, kardiyomiyositleri yetişkin kalpten tekrarlıca izole etmek ve DNA içeriğini ve nükleasyonu ölçmek için bir yöntem geliştirmektir.

İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Burada sunulan protokol, kardiyak yerleşik makrofajların fare kalplerinin sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyoventriküler düğüm (AVN) bölgesinden izolasyonu için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

Keşfedin fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri izolasyonunu perikardiyal yıkama yöntemiyle. Bu teknik, enzimatik sindirimin neden olduğu istenmeyen hücre aktivasyonunu önleyerek kalp bağışıklık hücrelerinin işlevselliğini korur.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Daha fazla video keşfet