Hepsi Bir Arada CRISPR Genom Düzenleme: CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Homoloji Odaklı Onarım Tabanlı Gen Knock-In İçin Bir Yöntem
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 5:12 dk. • July 8th, 2025
Bir tüpte bulunan bağışıklık hücrelerine hepsi bir arada CRISPR plazmidi ekleyerek başlayın. Bu plazmit, konakçı genomundaki hedef diziye tamamlayıcı olan sgRNA veya tek kılavuzlu RNA kodlama dizisi ile kombinasyon halinde bir Cas9 geni içerir.
Homoloji kolları veya HA'lar arasına sıkıştırılmış bir transgen içeren doğrusallaştırılmış bir donör plazmidi ekleyin - homolog rekombinasyon için gerekli DNA tekrarları. Plazmit karışımını hücreye enjekte etmek için elektrik akımı kullanan elektroporasyon gerçekleştirin. İçeri girdikten sonra, işlenmiş sgRNA, eksprese edilen Cas9 nükleazı ile bir kompleks oluşturur.
SgRNA, hedef bölgeyi bağlayarak Cas9 nükleazının protospacer bitişik motif veya PAM olarak bilinen spesifik tanıma dizisini tanımlamasına ve bunun yakınındaki konakçı DNA'yı parçalamasına izin verir. Bu, hücresel makinenin DNA'yı rezeke ettiği ve 3' çıkıntılar oluşturduğu künt uçlu bir çift iplikli kırılma yaratır. HA yan bölgelerinin varlığı, kesilen DNA'nın HA dizisine katıldığı ve heterodubleks bir yapı - D-döngüsü oluşturduğu homolojiye yönelik onarım mekanizmasını tetikler.
DNA sentezi, orijinal DNA zincirine yeniden katılana kadar transgen dizisine tamamlayıcı bir iplik ol
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin