JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 5:12 dk. • July 8th, 2025
Bir tüpte bulunan bağışıklık hücrelerine hepsi bir arada CRISPR plazmidi ekleyerek başlayın. Bu plazmit, konakçı genomundaki hedef diziye tamamlayıcı olan sgRNA veya tek kılavuzlu RNA kodlama dizisi ile kombinasyon halinde bir Cas9 geni içerir.
Homoloji kolları veya HA'lar arasına sıkıştırılmış bir transgen içeren doğrusallaştırılmış bir donör plazmidi ekleyin - homolog rekombinasyon için gerekli DNA tekrarları. Plazmit karışımını hücreye enjekte etmek için elektrik akımı kullanan elektroporasyon gerçekleştirin. İçeri girdikten sonra, işlenmiş sgRNA, eksprese edilen Cas9 nükleazı ile bir kompleks oluşturur.
SgRNA, hedef bölgeyi bağlayarak Cas9 nükleazının protospacer bitişik motif veya PAM olarak bilinen spesifik tanıma dizisini tanımlamasına ve bunun yakınındaki konakçı DNA'yı parçalamasına izin verir. Bu, hücresel makinenin DNA'yı rezeke ettiği ve 3' çıkıntılar oluşturduğu künt uçlu bir çift iplikli kırılma yaratır. HA yan bölgelerinin varlığı, kesilen DNA'nın HA dizisine katıldığı ve heterodubleks bir yapı - D-döngüsü oluşturduğu homolojiye yönelik onarım mekanizmasını tetikler.
DNA sentezi, orijinal DNA zincirine yeniden katılana kadar transgen dizisine tamamlayıcı bir iplik oluşturarak devam eder. D-döngüsünün üst kısmı, DNA'nın eksik kısmını sentezlemek için bir şablon görevi görür ve dört DNA zincirinin etkileşime girdiği yapılar olan çift Holliday bağlantılarını oluşturur. Bu bağlantılar çözülür ve boşluklar onarılarak hedef genin yerleştirilmesini kolaylaştırır.
Her oyukta antibiyotik içermeyen 500 mikrolitre tam büyüme ortamı içeren 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Plakayı nemlendirilmiş 37 derece% 5 karbondioksit inkübatörde önceden ısıtın. Elektroporasyon sistemini açın. JURKAT veya RAW hücreleri için giriş elektroporasyon parametreleri.
Elektroporasyon için hücre-DNA karışımını hazırlayın. JURKAT hücre kültürünü 25 santimetre karelik şişede toplayın. Hücreleri 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 90 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
Süpernatanlara gelince, yıkamak için hücreleri 5 mL DPBS ile yeniden süspanse edin. Ardından, önceki adımla aynı koşulu kullanarak hücre süspansiyonunu santrifüjleme ile döndürün. DPBS'yi çıkarın ve 2 mL DPBS kullanarak hücre peletini yeniden süspanse edin. 10 mikrolitre hücre süspansiyonu kullanın ve eşit hacimde %0,2 tripan mavisi ile karıştırın.
Hücre sayısını tahmin etmek için, numuneyi bu sayma slaydına yükleyin. Otomatik hücre sayacına sayma slaydı ekleyin ve hücrelerin görüntüsünü görüntüleyin, ardından bir hücre sayımı sonucu alın. Knock-in deneyi başına 5 elektroporasyon tekrarı için 2 milyon hücre hesaplayın.
Gerekli sayıda hücreyi 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjleme ile pelet hücreleri. Zamandan tasarruf etmek için, santrifüjleme aşaması sırasında elektroporasyon karışımı hazırlanabilir. Yeni bir 1.5 mL santrifüj tüpünde toplam 55 mikrolitre hacme kadar her bir CRISPR-Cas9 vektörünün 2.5 mikrogramını, 2.4 mikrogram doğrusallaştırılmış hedefleme vektörünü ve yeniden süspansiyon Tamponu R'yi ekleyin.
Yavaşça girdap yapın ve iyice karıştırmak için kısaca döndürün. Kullanmadan önce elektroporasyon karışımını oda sıcaklığında bırakın. Döndürdükten sonra DPBS'yi aspire edin, ardından 30 saniye daha santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın. Hazırlanan elektroporasyon karışımını ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
Elektroporasyon: Hücre elektroporasyon karışımına gelince, pipetli 10 mikrolitrelik bir nükleofeksiyon ucu kullanın.
Önemli: Pipetleme sırasında hava kabarcıklarından kaçının, bu, elektroporasyon arızasına neden olur. "Başlat" a basın.
Elektroporasyondan sonra, numuneyi önceden ısıtılmış büyüme ortamına sahip 24 oyuklu plakalardan oluşan bir kuyucuğa aktarın. Kalan 4 kopya numunesi üzerinde yukarıdakiyle aynı elektroporasyon prosedürlerini gerçekleştirin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. FACS hücre sıralamasından önce hücreleri 37 derecelik inkübatörde 48 ila 72 saat inkübe edin.