TALEN Aracılı Hedefli Gen Entegrasyonu: Floresan Protein Geninin hiPSC'lere Hassas Bir Şekilde Yerleştirilmesi için Tasarlanmış Diziye Özgü Nükleazların Kullanılması

Ortamda insan kaynaklı pluripotent kök hücre veya hiPSC süspansiyonu ile başlayın. Bir çift transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleaz veya TALEN kodlayan plazmit ekleyin. Bir floresan protein geni taşıyan, bir antibiyotik direnç genine bağlanmış, hedef lokuslara spesifik hizalama için bitişik homoloji kolları olan bir donör plazmidi ile takviye edin.

Hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturmak için karışımı elektropoze edin ve plazmit içselleştirmesini sağlayın. Hücrelerin içine girdikten sonra, TALEN kodlayan plazmitler işlenir ve TALEN'ler üretir - spesifik olmayan bir FokI kısıtlama endonükleaz bölünme alanına kaynaşmış bölgeye özgü bir TALE DNA bağlama alanından oluşan kimerik proteinler.

Her bir TALEN monomeri, tandem amino asit tekrar modüllerini içeren DNA bağlama alanı aracılığıyla, bir ara parça dizisi ile ayrılmış, zıt yönlerde her DNA zinciri üzerinde, nükleotid başına bir modül olan hedef lokusları tanır ve bunlara bağlanır. FokI alanları daha sonra ara parça dizisi içinde DNA'yı dimerize eder ve parçalar, çıkıntılarla çift iplikli kırılmalar oluşturur.

Bölünmüş bölgeyi çevreleyen bölgelere tamamlayıcı homoloji kolları içeren donör plazmidin varlığında, çift iplikli kırılmaları köprülemek için DNA onarım sentezi için şablon olarak homolog diziyi kullanarak homolojiye yönelik onarım gerçekleşir. Çentiklerin bağlanmasını takiben, araya giren floresan proteini ve antibiyotiğe dirençli genler konakçı genomuna entegre olur.

Büyümeyi desteklemek için besleyici bir hücre tabakası üzerine ekilen hiPSC'leri antibiyotik içeren ortamlarla tedavi edin. Promotörsüz antibiyotik direnç geni - yukarı akış endojen promotör tarafından yönlendirilir - TALEN ile düzenlenmiş hücrelerin seçimini kolaylaştırır.

iPSC kültürlerini her biri PBS ile bir kez yıkayarak başlayın, daha sonra her bir oyuğa 1 mililitre 37 santigrat derece yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri yaklaşık 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin %50'sinden fazlası kültür kabından ayrıldığında, kalan hücre kümelerini veya bağlı hücreleri mekanik olarak parçalamak için bir P1000 pipeti kullanın. Daha sonra, her bir oyuğa 2 mililitre E8 ortamı ekleyin ve kültürleri tek hücreli süspansiyonlara daha fazla ayırmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Şimdi, hasat edilen hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve döndürün. Saymak için peleti minimum miktarda E8 ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, kültürlerin tripan mavisi dışlaması ile canlılığını ve yeterli ayrışmasını doğruladıktan sonra, iki adet 15 mililitrelik konik tüpün her birine 3 milyon hücre aktarın.

Hücreler santrifüjlenirken, elektroporasyon sistemini insan embriyonik kök hücre hattı H9 için hücre tipine özel programa ayarlayın. Daha sonra, kontrol numunesi için 1 pelete tek başına 10 mikrogram homolog rekombinasyon donörü ve deney numunesi için her bir TALEN plazmidinden 5 mikrogram ile birlikte 10 mikrogram homolog rekombinasyon donör plazmidi ekleyin.

Daha sonra, kontrol ve deneysel peletlerin her birine 100 mikrolitre oda sıcaklığında tam P3 birincil hücre transfeksiyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Numuneleri ayrı küvetlere aktarın ve ardından numuneleri elektroporate edin. Transfeksiyondan hemen sonra, her küvete 500 mikrolitre oda sıcaklığında E8 ortamı ekleyin ve ardından kesilen iPSC örneklerini DR4 fare embriyonik fibroblastları içeren 10 santimetrelik ayrı ayrı kaplara damla damla aktarın.