phiC31-İntegraz Aracılı Bölgeye Yönelik Transgen Entegrasyonu: Bir Anofel Vektörüne Bölgeye Özgü Transgen Entegrasyonu için Bir Mikroenjeksiyon Tekniği

phiC31 integraz, yabancı bir gen olan bir transgenin bir konakçı genomuna bölgeye özgü rekombinasyonunu katalize eden faj türevli bir rekombinaz enzimidir. Bir Anofel konakçısında transgen entegrasyonu için, uygun bir tamponda bir Anofel embriyosu ile başlayın.

Anofel genomu, gen entegrasyonu için bir bağlanma bölgesi ve görsel seçim için bir camgöbeği-floresan işaretleyici ile önceden tasarlanmıştır. Daha sonra, istenen transgen kargosunu, bir bağlantı yerini, bir kırmızı floresan işaretleyiciyi ve plazmit omurga bileşenlerini bir şişeye taşıyan küçük bir hacimde donör plazmidi ekleyin. Ardından, gen kodlayan bir integraz taşıyan bir yardımcı plazmitin optimum hacmini ekleyin. Şimdi, plazmit karışımını bir mikroşırıngaya yükleyin.

Plazmitleri, germ hücrelerinin köken yeri olan embriyonun arka kutbuna nazikçe enjekte edin, bu da sitoplazmanın hafif bir hareketine neden olur. Embriyonun içine girdikten sonra, yardımcı plazmit integraz enzimlerini sentezlemeye başlar.

İntegraz enzimi, donör plazmid ve konakçı genomu arasında bölgeye özgü rekombinasyona aracılık eder. Böylece, donör plazmidinden gelen transgen ve kırmızı floresan işaretleyici, Anofel genomundaki rekombinant bağlanma bölgelerine entegre olur. Daha sonra, enjekte edilen embriyoyu aralıklı girdap ile kuluçka için fizyolojik koşullar altında kuluçkaya yatırın.

Birkaç gün içinde embriyo yumurtadan çıkar ve bir larvaya dönüşür. Bir floresan mikroskobu altında, başarılı bir şekilde entegre edilmiş genlere sahip Anofel larvası, hem konakçı genomunu işaretleyen camgöbeği floresansını hem de donör plazmidinden transgeni işaretleyen kırmızı floresansı eksprese eder.

Endotoksin içermeyen bir saflaştırma kiti kullanarak donör ve yardımcı plazmitleri saflaştırın. Donör plazmidin mikrolitresi başına 350 nanogram ve yardımcı plazmidin mikrolitresi başına 150 nanogramlık bir nihai konsantrasyona sahip bir karışım elde etmek için, ilgilenilen transgeni taşıyan attB etiketli donör plazmidini ve integrazı taşıyan yardımcı plazmidi birleştirin.

DNA'yı, 2,5 hacim buz gibi %100 etanol içinde 0.1 hacim 3 molar sodyum asetat ekleyerek çökeltin. Sonra, girdap. Beyaz bir çökelti hemen görünür olmalıdır. Peleti yıkayın ve mikrolitre başına 500 nanogramlık toplam nihai konsantrasyona ulaşmak için enjeksiyon tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, her biri 10 ila 15 mikrolitrelik alikotlar hazırlayın ve bunları eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Mikroenjeksiyondan 72 saat önce 4 ila 7 günlük sivrisinekleri istenen yerleştirme hattından ve vahşi tip muadillerinden kan ile besleyin. Embriyonun arka kutbunu 45 derecelik bir açıyla hedefleyerek 25 milimolar sodyum klorür içinde Anopheles gambiae embriyo mikroenjeksiyonlarını gerçekleştirin.

Arka kutbu 30 derecelik bir açıyla hedefleyerek halokarbon yağında Anopheles stephensi embriyo mikroenjeksiyonlarını gerçekleştirin. Enjeksiyondan hemen sonra, yumurtaları steril damıtılmış suyla doldurulmuş bir petri kabına aktarın ve böcek koşullarına geri koyun. Yumurtadan çıktıktan sonra, G₀ larvalarını her gün tuzlu damıtılmış su içeren bir tepsiye aktarın ve tekrar pupalara aktarın.