CRISPR Girişim Tabanlı Gen Susturma: Patojenik Leptospira'da Gen Fonksiyonunun Hedefli Baskılanması İçin Bir Teknik
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 7:27 dk. • July 8th, 2025
CRISPR girişimi veya CRISPRi, gen fonksiyonunu baskılayan hedeflenen gen susturma için devre dışı bırakılmış bir Cas9 varyantı olan dCas9'u kullanır.
CRISPRi'yi gerçekleştirmek için, hem E. coli hem de Leptospira bakterilerine karşılık gelen replikasyon kökenlerini içeren ve her iki türde de yayılmayı kolaylaştıran bir mekik vektör yapısı kullanın.
Vektör ayrıca, hedef diziyi tanımak için dCas9 genine özgü bir dizi ve tek kılavuzlu bir RNA veya sgRNA içerir.
Başlangıçta, mekik vektörü donör E. coli'nin içinde bulunur. Konjugasyonu kolaylaştırmak için donör E. coli kültürünü konakçı Leptospira ile destekleyin. Konjugasyon, organizmalar arasında doğrudan hücreden hücreye temas kurarak Leptospira tarafından mekik plazmid alımını kolaylaştırır. Hücrenin içinde, plazmit yapısı sgRNA dizileri üretir ve dCas9 proteinlerini eksprese eder.
sgRNA, Leptospira DNA'sı üzerindeki tamamlayıcı hedef bölgesini tanıyan, protospacer bitişik motifine veya PAM'a yakın bir protospacer bölgesi içerir - konakçı DNA üzerinde kısa bir tanıma dizisi. Bu, dCas9'un, gen transkripsiyonu başlangıç bölgesine akış aşağısındaki hedef bölgedeki sgRNA ile bir kompleks oluşturmasına yardımcı olur.
sgRNA-dCas9 kompleks
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin