CreER-LoxP Sistem Tabanlı Hedef Gen İnaktivasyonu: Bir Fare Modelinde Hedef Gen Nakavt için Tamoksifen ile İndüklenebilir Cre Rekombinaz Sistemi

İlgilenilen geni çevreleyen LoxP bölgelerini (Cre-rekombinaz enzimleri tarafından tanınan spesifik diziler) barındıran değiştirilmiş bir genom içeren genetik olarak tasarlanmış bir fare modeliyle başlayın. Fare ayrıca organa özgü CreER rekombinazı kodlayan bir plazmit vektörü ile transfekte edilir ve bu da CreER rekombinaz eksprese eden elementin karaciğer hücrelerinin genomuna entegrasyonuna yol açar.

Cre rekombinaz ve östrojen reseptörü ER'nin mutant ligand bağlama alanını içeren aktif olmayan bir füzyon proteini olan eksprese edilen CreER rekombinazı, sitoplazmadaki ısı şoku proteini ile etkileşime girer ve bağlanır. Bu bağlanma, sitoplazmada CreER rekombinazı sınırlar.

Etanol ve uygun yağ kullanarak hidrofobik bir ilaç olan tamoksifen çözeltisi hazırlayın. Şimdi, karın organlarına zarar vermemek için tamoksifen solüsyonunu farenin karnının sol alt kadranına intraperitoneal olarak enjekte edin.

Enjekte edilen tamoksifen karaciğerde 4-hidroksitamoksifen, 4-OHT'ye metabolize edilir. Ayrıca, seçici bir östrojen reseptör modülatörü olan 4-OHT, CreER rekombinazının ER-ligand bağlanma alanına bağlanarak konformasyonel değişikliğine neden olur. Bu, ısı şoku proteininden CreER rekombinazının salınmasına yol açar.

Aktive edilmiş CreER rekombinazları çekirdeğe translokasyon yapar ve konakçı genomundaki LoxP bölgelerini tanır. CreER rekombinazları, LoxP bölgeleri arasındaki bölgeye özgü rekombinasyonu katalize eder, bu da ilgilenilen genin eksizyonu ile sonuçlanır ve böylece dokuya özgü gen nakavtını sağlar.

Entegre olmayan vektörlerin temizlenmesini sağlamak için kuyruk veni enjeksiyonundan 10 ila 15 gün sonra Cre Rekombinaz indüksiyonunu başlatın. 10 miligram tamoksifeni 40 mikrolitre etanol içinde çözün ve 55 santigrat derecede 10 dakika çalkalayarak inkübe edin.

Tamoksifen eriyene kadar birkaç kez vorteks yapın, ardından 960 mikrolitre mısır yağı ekleyin ve 55 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin. Soğuduktan sonra, çözeltiyi 20 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir insülin şırıngasına çekin, ardından 27 gauge iğneye geçin.

Enjekte etmek için, önce, farenin boynunu başparmağınız ve ikinci parmağınızla dikkatlice tutarak, kuyruğu elin tabanı ile dördüncü ve beşinci parmak arasına sabitleyerek fareyi tırmalayın, ardından intraperitoneal olarak 0.1 mililitre solüsyonu karnın sol alt çeyreğine enjekte edin.