JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:34 dk • July 8th, 2025
Küçük enterferans yapan RNA'nın veya bir çift sarmallı RNA sınıfı olan siRNA'nın yapışık olmayan adipositlere veya yağ hücrelerine ters transfeksiyonu için, adipositlerde spesifik bir protein kodlayan geni hedefleyen bir siRNA süspansiyonu hazırlayın. Uygun bir katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ekleyin. Elektrostatik etkileşimler yoluyla transfeksiyon kompleksleri oluşturmak için karışımı inkübe edin.
Karışımı çok kuyulu bir plakanın kollajen kaplı kuyucuklarına aktarın. Transfeksiyon kompleksleri, spesifik olmayan etkileşimlerle plaka kaplaması üzerinde hareketsiz hale gelir. İmmobilize transfeksiyon kompleksleri içeren kuyucuklara bir adiposit süspansiyonu pipetleyin. Adipositler, plaka kaplamasına gevşek bir şekilde yapışarak hücreler ve kompleksler arasındaki fiziksel teması arttırır.
Transfeksiyon kompleksi hücre zarına kaynaşır ve siRNA'yı sitoplazmaya iletir. mRNA'yı hedeflemek için tamamlayıcı bir diziye sahip bir antisens iplik ve bir duyu ipliği içeren siRNA, çok proteinli RNA'yı indükleyen susturma kompleksi veya RISC tarafından tanınır. siRNA, RISC'ye bağlanır ve iplikler ayrılır, antisens iplik komplekse bağlı kalır.
Aktive edilmiş siRNA-RISC kompleksi, hedef mRNA üzerindeki tamamlayıcı bölgeleri tanır ve bunlara bağlanır. Bu, RISC kompleksinin argonaute proteini tarafından mRNA'nın diziye özgü bölünmesine yol açar. Bölünmüş mRNA, hücresel mekanizma tarafından daha da bozulur, böylece hedef gen ekspresyonunu susturur.
siRNA'yı karıştırmak için geliştirilmiş minimum esansiyel ortamla pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş minimal esansiyel ortamı siRNA'ya ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, transfeksiyon karışımını kollajen kaplı plakanın her bir oyuğuna ekleyin.
100 milimetrelik Petri kabındaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5X tripsin ekleyin ve tüm yüzeyi tripsin ile kapladığınızdan emin olun. 30 saniye bekleyin ve tripsini dikkatlice çıkarın. Petri kabını inkübatörde 37 °C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin.
Ardından, hücre hasarını önlemek için hücreleri ayırmak için tabağa hafifçe vurun. Tripsini nötralize etmek için piruvat, 25 mM glikoz, %10 FCS ve %1 penisilin ve streptomisin içermeyen 10 mililitre DMEM ekleyin. Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
Bir Malassez sayma odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonunu 6.25 x 105 hücre / mL ortama ayarlayın. 12 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 800 mikrolitre hücre süspansiyonu veya transfeksiyon karışımını içeren 24 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 400 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın.
Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin ve 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatanı piruvat, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin içermeyen taze DMEM ile dikkatlice değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.