İndüklenebilir Tet-Off Düzenlenebilir Sistemi: Tetrasiklin Kapalı Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Gen Ekspresyonunu Modüle Etmek İçin Bir İn Vitro Yöntem
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 6:19 dk. • July 8th, 2025
Bir tüpte kültürlenmiş alıcı hücrelerin bir süspansiyonunu alarak başlayın. Tüpü, ilgilenilen geni içeren indüklenebilir plazmitlerle destekleyin. Bu genin ekspresyonu, bir tetrasiklin operatörüne veya TetO'ya kaynaşmış ve tetrasikline duyarlı bir element veya TRE oluşturan bir yukarı akış promotör dizisinin kontrolü altındadır.
Ek olarak, her biri rekombinant tetrasiklin transaktivatör proteinini veya tTA'yı kodlayan bir gen içeren düzenleyici tetrasiklin kapalı vektörleri ekleyin. Plazmitlerin hücre tarafından alımını kolaylaştırmak için elektrik darbeleri kullanmak için hücre-DNA karışımını elektropoze edin.
Elektroporasyon sonrası, hücreleri plakalayın ve istenen süre boyunca inkübe edin. Çekirdeğe girdikten sonra, tetrasiklin kapalı vektörü tTA proteinini eksprese eder. tTA, bir Tet baskılayıcı veya TetR parçası ve bir viral VP16 transkripsiyon transaktivatör alanı içeren hibrit bir proteindir.
TetR kısmı, TRE elementinin TetO dizisini bağlarken, VP16 alanı, RNA polimerazın mRNA'yı aşağı akış DNA'sından sentezlemesine izin verir ve sonunda gen ekspresyonuna yol açar. Kültür plakasındaki büyüme ortamını doksisiklin içeren ortamla değiştirin ve inkübe edin.
Sentetik bir tetrasik
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin