Morfolino Aracılı Gen Düzenleme: Tek Hücreli Mağara Balığı Yumurtalarında Translasyonel Bloke Edici Morpholino Oligonükleotidleri Kullanan Bir Gen Yıkma Tekniği

Morfolinolar, doğal nükleotidlere kıyasla fosfat omurgası ve şeker yapılarında farklılıklar olan kısa, tek sarmallı, yeniden tasarlanmış oligonükleotidlerdir. Bu özellikler morfolinoların fizyolojik pH'daki stabilitesini arttırır. Bu varyasyonlara rağmen, morfolinolar, yıkılması istenen bir hedef genden spesifik mRNA dizisine tamamlayıcı oligonükleotidin tasarlanmasına yardımcı olan standart nükleobazları içerir.

Morfolino güdümlü gen düzenlemesi yapmak için, bir agaroz enjeksiyon plakasının kuyucuklarına yerleştirilmiş tek hücreli mağara balığı yumurtalarını alarak başlayın. Yumurtanın içinde bulunan sıvı dolu bir yapı olan yumurta sarısı kesesini bulmak için yarı saydam ve yuvarlak yumurtaları görselleştirin.

Tasarlanmış morfolinos içeren bir çözelti ile önceden doldurulmuş bir mikroenjeksiyon iğnesi alın. Solüsyonu doğrudan yumurta sarısına enjekte edin ve morfolinoların hücre sitoplazmasına girmesini sağlayın. Hücrelerin içinde hedef gen, sitoplazmaya taşınan mRNA'yı oluşturur.

Sitoplazma içinde, enjekte edilen morfolino, endojen başlatma bölgesinde tamamlayıcı hedef mRNA transkripti ile hibritleşir ve onun ötesine uzanır. Bu işlem, ribozomun daha büyük alt biriminin, bazı spesifik proteinlerle komplekslenmiş küçük ribozomal alt birimden oluşan yeni oluşan translasyon başlatma kompleksi ile bağlanmasını bloke eder.

Daha sonra, translasyon başlatma kompleksinin ilerlemesi sterik olarak engellenir, bu da mRNA'nın proteine translasyonunu durdurur. Son olarak, hedef protein konsantrasyonu, morfolinolar tarafından translasyonel blokaj nedeniyle azalır.

Enjeksiyon gününde, tek hücreli yumurtaları enjeksiyon plakasına aktarmak için bir cam pipet kullanın ve enjeksiyon plakasının beş sırasına kadar sıra başına 30 ila 40 yumurta doldurun. Yumurtaları az miktarda balık sistemi suyu ile nemlendirin. Morfolinoyu buz üzerinde çözdürün ve enjeksiyon solüsyonunu, uzun bir Microloader pipet ucu kullanarak veya sonuna 2 ila 4 mikrolitrelik bir bolus ekleyerek yumurta başına 400 pikogram morfolino enjekte edilecek şekilde hazırlayın.

Tüm iğneler yüklendiğinde, enjeksiyon iğnesi uçlarındaki fazla uzunluğu kesmek için forseps kullanın ve ilk iğneyi bir pikolitre mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin. Daha sonra, enjeksiyon kabını bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve 1 nanolitre morfolino enjeksiyon solüsyonunu doğrudan yumurta sarısına enjekte etmeden önce her bir yumurtaya iğne ile nüfuz etmek için mikromanipülatörü kullanın.