JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 5:40 dk • July 8th, 2025
Bir mikroenjeksiyon kalıbının kuyucuklarına yerleştirilmiş canlı, tek hücreli aşama zebra balığı embriyoları ile başlayın.
Tol2 transpozaz kodlayan mRNA ve transpozon donör plazmitleri içeren bir çözelti ile bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Plazmitler, her yerde bulunan bir zebra balığı promotörü ve Tol2 transpozon kolları ile çevrili bir floresan protein kodlayan gen içerir.
Mikroenjeksiyon solüsyonunu zebra balığı embriyosunun sitoplazmasına dikkatlice enjekte edin. Hücre içinde, Tol2 transpozaz mRNA'ları Tol2 transpozaz proteinlerine dönüşür ve aktif olarak çekirdeğe taşınır.
Donör plazmidindeki Tol2 bölgeleri, raportör geni çevreleyen spesifik ters çevrilmiş terminal tekrarları veya ITR'leri içerir. ITR'ler kısa, doğrudan tekrarlarla çevrilidir. Transpozaz proteinleri, ITR bölgelerini tanır ve bunlara bağlanır, bu da yan DNA üzerinde bir saç tokası oluşturur. Transpozazlar, transpozon yapısını yan DNA'dan daha da böler, onu plazmidden serbest bırakır ve kısa, doğrudan tekrarları geride bırakır.
Transpozazlar, somatik hücre genomunda kademeli bir çift sarmallı kırılma oluşturur ve transpozon yapısını genom bölgesine yerleştirir. Kademeli uçların DNA polimeraz ile boşluk doldurulması ve ardından çentiklerin ligasyonu kısa, doğrudan tekrarlar oluşturur.
Ligasyon, somatik hücre genomuna stabil transpozon yapı entegrasyonuna neden olur ve promotör, floresan protein ekspresyonunu kolaylaştırır. Enjekte edilen embriyoları inkübe edin. Embriyonik gelişim sırasında, somatik hücreler farklı hücre tiplerine yol açar ve transgenik zebra balığı oluşturur.
Tol2 transpozaz mRNA ve enjeksiyon çözeltisini hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, enjeksiyondan önceki öğleden sonra, en az iki erkek ve iki dişi ile dört ila altı üreme tankı kurun. Balık atığı miktarını azaltmak ve üreme tepkisi oluşturmak için balıkları öğleden sonra beslemekten kaçının.
Ertesi sabah, hazırlanan enjeksiyon solüsyonunu eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve buzun üzerine koyun. Balık yetiştirme tanklarındaki bölücüleri çekin ve balıkların çiftleşmesine izin verin. Genel olarak, balıklar 20 ila 30 dakika içinde yumurta bırakır.
Beklerken, aşağıdaki parametrelere sahip bir mikropipet çektirmesi kullanarak, iğneleri kılcal camdan çekin. İğnenin ucunu kırmak ve eğimli bir kenar oluşturmak için bir laboratuvar mendili kullanın. Embriyo mortalitesini azaltmak için daha küçük bir çap tercih edilir.
Balıklar yumurtladıktan sonra, onları 10 santimetre çapında bir Petri kabında toplayın. Hemen diseksiyon mikroskobu altında, tüm anormal embriyoları ve balık atıklarını çıkarın. Daha sonra döllenmiş embriyoları hazırlanmış% 3'lük bir agaroz enjeksiyon kalıbına pipetleyin. Embriyoların yerinde kalmasına yardımcı olmak için fazla suyu alın.
Tüm sıralar canlı embriyolarla doldurulduktan sonra, bunları, tek hücrelerin tümü iğneye göre yatay olarak 45 derecelik bir açıyla yönlendirilecek şekilde düzenleyin. Bu, enjeksiyonu daha sonra çok daha kolay hale getirecektir. Daha sonra, eldiven giyerken, hazırlanan yapının 5 mikrolitresini buz üzerindeki tüpten çıkarmak için 20 mikrolitrelik bir yükleme pipet ucu kullanın.
Pipet ucunu, reaktifi uca mümkün olduğunca yaklaştırmak ve kılcal damara atmak için kırık kılcal borunun arka ucuna, sivrilmeye başladığı yere dikkatlice yerleştirin. Hala hava kabarcıkları varsa, ucu kırmamaya dikkat ederek iğneyi sallayın.
İğneyi doğrudan mikroenjeksiyon iğne tutucusuna yerleştirin ve iğne yerinde kalana kadar dikkatlice sıkın, ardından açıyı yaklaşık 45 dereceye ayarlayın. İğne hazırlanıp takıldıktan sonra mikroskobu ve gaz basınç tankını açın. Tutma için yaklaşık 0,5 PSI ve çıkarma için 30 PSI kullanarak enjeksiyon hacmini ayarlayın.
Pedala basarken solüsyonun iğneden çıktığını kontrol edin. Bir damla mineral yağ içeren bir aşama mikrometresi kullanarak, çözeltinin hacmini ve akışını yaklaşık 10 mikrometre çapa ayarlayın. Karşı basıncın iğneden az miktarda çözelti damlamasına izin verdiğinden emin olun.
Yeterli geri basınç yoksa, kılcal hareket sıvının iğneye girmesine ve mRNA'nın tahrip olmasına neden olur. İğne kalibre edildikten sonra, embriyoyu yerinde tutan bir destek sağlamak için jel çentiğinin kenarını kullanarak iğneyi döllenmiş embriyoların tek hücresine yerleştirin ve iğnenin embriyoyu hareket ettirmeden basınç uygulamasına izin verin.
İğnenin ucu tek hücreye girdikten sonra, istenen miktarda çözeltiyi serbest bırakmak için pedala basın. Transgenik zebra balığı üretmek için çözeltinin yumurta sarısına değil, hücreye enjekte edilmesi önemlidir. Bu işlemi tüm embriyolar için tekrarlayın.
Tamamlandığında, enjekte edilen embriyoları agaroz çentiğinden durulayarak etiketli bir tabağa aktarmak için tek kullanımlık 3.4 mililitrelik bir transfer pipeti ve balık sistemi suyu kullanın. Embriyoları gelişmelerine izin vermek için 28,5 santigrat derecelik bir inkübatörde saklayın.