JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:29 dk. • July 8th, 2025
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin, hiPSC'lerin uygun elektroporasyon tamponunda askıya alınmasıyla başlayın. PiggyBac transpozaz kodlayan plazmitler ve donör plazmitlerinden oluşan bir çözelti ekleyin. Karışımı elektrostatik hale getirin.
Elektrik darbeleri, hücre zarlarına geçici olarak nüfuz ederek plazmitlerin hücresel alımını kolaylaştırır. Donör plazmitleri, hedef protein ve antibiyotik direnç genlerini braketleyen TTAA tekrarları ile çevrili, birbirinin ters çevrilmiş tamamlayıcıları olan transpozona özgü ters terminal tekrarları, ITR'leri içerir.
İfade edilen PiggyBac transpozaz proteinleri, ITR'lerin 3' uçlarında, TTAA tekrarlarının içinde çentikler oluşturur. Maruz kalan 3'-hidroksil grupları, yan DNA içindeki tamamlayıcı ipliğin nükleotidine saldırır, transpozon uçlarında TTAA saç tokaları oluşturur, böylece plazmidden transpozon yapısını serbest bırakır.
Transpozazlar, transpozon yapısının 5' uçlarında TTAA çıkıntıları oluşturmak için saç tokalarını çözer. Transpozazlar ayrıca konak genomundaki TTAA dizisinde çift iplikli kırılmalar oluşturur. Serbest bırakılan 3'-hidroksil transpozon uçları, kademeli uçlarda TTAA dizisine saldırır, bu da transpozon yapısının konakçı genomuna kovalent olarak katılmasına neden olur ve transpozon yapısını çevreleyen tek iplikli boşluklar bırakır. Konak DNA'sındaki bu boşluklar bağlanır ve transpozon yapısının kararlı bir şekilde bütünleşmesine yol açar.
Hücre dışı matriks proteini kaplı bir plaka üzerine ekilen hiPSC'leri antibiyotik içeren ortamla tedavi edin. Yukarı akış promotörü tarafından yönlendirilen antibiyotik direnç geni, gen düzenlenmiş hücrelerin seçilmesini sağlar.
Hücreleri 37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika hücre ayrışma reaktifi ile tedavi etmeden önce insan iPSC kültürünü kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulayın. Hücreler kültür kabından ayrılmaya başladığında, hücreleri 3 ila 4 kez nazikçe manuel olarak ayırmak için bir P1000 pipeti kullanın.
Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve saymak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen taze PBS ile son hacmi 10 mililitreye getirin. Santrifüjleme ile 1 x 106 hücre toplayın ve peleti elektroporasyon kitinden 100 mikrolitre tampon R içinde yeniden süspanse edin.
Transfeksiyon için 4.5 mikrogram transpoze edilebilir vektör plazmit DNA'sı ve 0.5 mikrogram PiggyBac transpozaz plazmit DNA'sı ekleyin. Belirtilen parametrelerle üreticinin talimatlarına göre hücre elektroporasyon sistemi ile transfekte edin. Sonra. hücreleri, 6 milimetre matris kaplı bir tabakta 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş insan iPSC ortamında tohumlayın.