JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:13 dk • July 8th, 2025
CRISPR-concatemer-Cas9 sistemini kullanarak birden fazla geni aynı anda devre dışı bırakmak için, fare bağırsak hücresi süspansiyonunu içeren bir tüp ile başlayın. Tüpü, birbirine bitişik olarak entegre edilmiş çoklu kılavuz RNA'lar veya gRNA'lar için ifade kasetini içeren CRISPR-birleştirici vektörlerle destekleyin.
Her gRNA kaseti, amaçlanan geni ayrı ayrı devre dışı bırakmak için özel olarak tasarlanmıştır. Aynı tüpe Cas9 endonükleazını kodlayan ifade vektörleri ekleyin. Hücre-plazmit karışımını elektropore edin - plazmitlerin hücreye girişini kolaylaştırmak için elektrik akımı kullanan bir teknik. Hücrenin içinde, CRISPR birleştirici ve Cas9 vektörünün birlikte ekspresyonu, sırasıyla gRNA dizilerini ve Cas9 nükleazlarını oluşturur.
Her gRNA dizisi, karşılık gelen Cas9 enzimine bağlanarak, konakçı genomundaki hedef bölgelere bağlanan çoklu Cas9-gRNA kompleksleri oluşturur. Bu bağlanma, her iki DNA zincirinde de protospacer bitişik motifine veya PAM bölgesine yukarı akışta bir çentik üreten Cas9 enzimini aktive eder. Bu, hedef DNA'da çift iplikli bir kırılma veya DSB ile sonuçlanır.
Hedef gene herhangi bir homolog dizinin yokluğunda, hücrenin homolog olmayan uç birleştirme adı verilen endojen onarım mekanizması tetiklenir ve onarım proteinlerinin ve kinaz moleküllerinin kırılma bölgesinde bağlanmasına izin verir. Daha sonra, ligaz enzimi DSB'yi onarır ve hedef gen dizisinin modifikasyonlarına neden olur. Bu modifikasyonlar, genlerin işlevini bozar ve birden fazla genin nakavt olmasına neden olur.
Hücre süspansiyonunu içeren 15 mililitrelik tüpe 9 mililitre indirgenmiş serum ortamı ekleyerek bu işleme başlayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400G'de santrifüjleyin. Tüm süpernatanı çıkarın ve peleti bir elektroporasyon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. İki yeni tüpe toplam 10 mikrogram DNA ekleyin. Daha sonra, 100 mikrolitrelik son hacme elektroporasyon solüsyonu ekleyin ve hücre-DNA karışımını buz üzerinde tutun.
Hücre-DNA karışımını elektroporasyon küvetine aktarın. Küveti elektroporatör haznesine yerleştirin. Elektroporatör üzerindeki uygun düğmeye basarak empedansı ölçün ve 0,030 ila 0,055 ohm olduğundan emin olun. Metin protokolünde belirtilen ayarlara göre elektroporasyon gerçekleştirin. Küvete 400 mikrolitre elektroporasyon tamponu artı ROCK inhibitörü ekleyin ve ardından tüm içeriğini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Hücrelerin iyileşmesini sağlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400G'de döndürün. Süpernatanı çıkarın ve peleti bodrum matrisinin kuyusu başına 20 mikrolitre içinde yeniden süspanse edin. 48 oyuklu bir plakada oyuk başına yaklaşık 1 x 104 ila 1 x 105 hücre tohumlayın ve EGF artı Noggin GSK-3 inhibitörü, ROCK inhibitörü ve% 1.25 dimetil sülfoksit ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede inkübe edin.