Multianalit İmmünoboncuk Testi: İnsan Serum Numunesinde Çoklu Antikor Alt Tiplerinin Eşzamanlı Tespiti için Akış Tabanlı Bir İmmünoassay Tekniği

Multianalit immünoboncuk testi, karşılık gelen hedef antikorlarını aynı anda tanımak için çoklu antijen kaplı mikroküreler kullanır.

Bu teste başlamak için, uygun tamponu içeren bir tüpte bir mikro boncuk karışımı alın. Her boncuk, yüzeyinde belirli bir antijen ile kaplanmıştır ve boncukların birbirinden kolayca ayırt edilmesini sağlar.

Kaplanmış immünoboncuk karışımını bir mikrotitre tahlil plakasının kuyucuklarına pipetleyin. Kuyucukları, farklı hedef antikor izotiplerini içeren serum numunesi ile destekleyin. Bu varyantların yapılarında ince farklılıklar vardır ve her bir oyuğun birden fazla birincil antikora sahip olmasına izin verir.

Örnek antikor izotiplerinin ilgili immünoboncuklarda yakalanan spesifik antijenlere bağlanmasına izin vermek için inkübe edin. Bağlanmamış primer antikorları çıkarmak için bir tahlil tamponu ile yıkayın. Birincil antikorun her bir varyantına karşılık gelen floresan boya etiketli ikincil antikorları kuyucuğa ekleyin.

Etiketli her ikincil antikor, ilgili birincil antikorun Fc bölgesine bağlanır. Çoklu boncuk yakalanan antijen-primer antikor kompleksleri floresan olarak etiketlenmiştir. Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için plakayı yıkayın.

Farklı floroforları kendi dalga boylarında aynı anda tespit edebilen bir floresan analizörü kullanarak plakayı okuyun. Sinyal tespitine bağlı olarak, serum antikorlarının çeşitli izotipleri ve bunların farklı antijenlere bağlanmaları değerlendirilebilir.

Test performansı için, birleştirilmiş mikroküreleri 30 saniye boyunca girdapla yeniden askıya alın ve 60 ila 90 saniye boyunca sonikat yapın. Ardından, her bir boncuk kolloidinden gerekli miktarı ilgili tüpten çıkarın ve boncuk kolloidlerini yeni bir 1.5 milimetre mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.

Ardından, tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmaya izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcı içindeyken, boncuk peletini bozmadan süpernatanı çıkarın.

Boncukları ayırıcıdan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre tahlil tamponunda tekrar süspanse edin. Boncukları ayırmak için tüpü 60 saniye boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirmeden önce 30 saniye boyunca vorteksleyin. Yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Daha sonra, her hedef için 1 μL'de 100 mikrokürelik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için uygun hacimde tahlil tamponu ekleyerek üç katlı çalışma mikroküre karışımının konsantrasyonunu ayarlayın.

25 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 96 mikrolitre mikroküre karışımı ekleyin. Plazma veya serum örneklerini tahlil tamponunda 500 kat seyreltin ve istenen titrasyona göre standart örnekleri hazırlayın.

Boş numune olarak 25 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin ve seyreltilmiş numunelerin veya standardın her birini, 96 oyuklu bir numune plakasının belirlenmiş her bir oyuğuna ekleyin. Bittiğinde, dakikada 700 dönüşe ayarlanmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmek için plakayı bir alüminyum conta veya folyo ile örtün.

Makalede tarif edildiği gibi, tahlil tamponu ile 4 μg / mL'de bir anti-insan tespit antikorları çözeltisi veya ikincil antikor çözeltileri hazırlayın. Hızlı bir şekilde yıkamak için plakayı manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve ardından sıvıyı kuyulardan çıkarmak için plakayı biyolojik tehlike kabı üzerinde zorla ters çevirin. Plaka hala ters çevrilmiş durumdayken, plakayı kalın bir tomar kağıda kuvvetlice vurun.

Daha sonra, her bir kuyuyu 100 mikrolitre tahlil tamponu ile yıkayın ve sıvıyı biyolojik tehlike kabı üzerinde zorla ters çevirerek çıkarın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kullanılmış tüm kağıt tomarlarını biyolojik tehlike içeren bir kaba atın.

Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 25 mikrolitre ikincil antikor çalışma çözeltisi ekleyin ve dakikada 700 dönüşte bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe etmek için plakayı alüminyum folyo ile kaplayın.

30 dakikalık inkübasyondan sonra, plakanın kuyularını daha önce gösterildiği gibi tahlil tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde beş dakika inkübe edin.

60 mikrolitrelik bir numuneyi cihaz analizörü aracılığıyla sistem kılavuzuna göre analiz edin.