JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:16 dk. • July 8th, 2025
Fosfolipitler, fosfat grupları içeren kompleks lipitlerdir. Bu moleküller fosfolipaz adı verilen bir enzim tarafından hidrolize edilir.
Fosfolipaz aktivite testini gerçekleştirmek için, enzim için substrat görevi gören fosfolipidler açısından zengin bir yumurta sarısı emülsiyonu alın. Sarsarı, sonraki adımlar sırasında yumurta sarısı proteinlerinin stabilitesini artıran sodyum klorür içeren ılık bir agaroz çözeltisine ekleyin.
Karışımı kalsiyum klorür ve bir floresan boya - rodamin ile destekleyin. Karışımı bir Petri tabağına dökün. Katılaşma üzerine, yumurta sarısı fosfolipitleri agaroz jel matrisi içinde homojen bir şekilde dağılmış halde kalır.
Bir tüp kullanarak, jel içinde uygun mesafeli kuyucuklar oluşturun. Kuyucuklara fosfolipaz içeren değişen konsantrasyonlarda ham protein özü ekleyin. Plakayı fizyolojik sıcaklıkta inkübe edin.
Ekstrakttan gelen fosfolipaz, radyal olarak jele yayılır. Jeldeki kalsiyum iyonları fosfolipaza bağlanarak enzimleri aktive eder. Bu enzim fosfolipitleri parçalayarak serbest yağ asitleri üretir. Jeldeki rodamin molekülleri, salınan yağ asitleri ile bir kompleks oluşturur.
Ultraviyole ışıkla aydınlatıldıktan sonra, kuyucukların etrafındaki floresan halelerin görünümünü gözlemleyin. Halo, enzim aktivitesinin varlığını doğrular. Daha yüksek fosfolipaz konsantrasyonları ile, enzim molekülleri daha fazla yayılır ve halo çapını arttırır.
Bir tavuk yumurtasını% 1 SDS ile damıtılmış suda yıkayın ve steril koşullar altında yumurta sarısını yumurta beyazından ayırın.
A, B, C ve D çözeltilerini hazırlayın. B çözeltisine 500 mikrolitre A ve C çözeltisi ve 100 mikrolitre D çözeltisi ekleyin. Bunları karıştırın ve her bir Petri kabına 25 mililitre dökün. Çözeltinin steril koşullar altında katılaşmasını bekleyin ve ince bir tüp ile yaklaşık 2 ila 3 milimetre çapında kuyular açın.
Bir kuyucuğa negatif kontrol olarak toplam 20 mikrolitre fosfat tamponu ve başka bir kuyucuğa pozitif kontrol olarak 20 mikrolitre belirlenmiş bir fosfolipaz ekleyin.
Kalan kuyucuklara 5, 15, 25, 35 ve 45 mikrogram olmak üzere farklı miktarlarda ham ekstrakt proteini yerleştirin, her biri 20 mikrolitrelik bir son hacimde. 37 santigrat derecede 20 saat inkübe edin.