Halka Şeklinde Mikro Modelleme Hücre Kiralite Deneyi: Halka Şeklindeki Mikro Desenlerde Hücre Hizalamasına Dayalı Çok Hücreli Kiraliteyi Belirlemek İçin İn Vitro Bir Teknik

İn vitro memeli hücre kiralitesini belirlemek için - hücrelerin sınırlayıcı koşullar altında sola veya sağa doğru hizalanması için sol-sağ önyargısı - ortam içeren çok kuyulu bir plakada özel olarak üretilmiş altın kaplı slaytlarla başlayın. Slaytlar, hücre yapışmasına dirençli kendinden montajlı tek tabaka ile doldurulmuş, hücre adezyonunu teşvik eden fibronektinin halka şeklindeki adalarının mikro modellerini içerir.

Daha sonra, slaytların üzerine uygun miktarda memeli hücre süspansiyonu tohumlayın ve inkübe edin. Hücreler, fibronektin içeren halka mikro modellerine adsorbe olur. Çevreleyen kendinden montajlı tek katman, halka sınırlarının dışında spesifik olmayan hücre bağlanmasını önler.

Medyayı, iliştirilmemiş hücreleri kaldırarak yeni medyayla değiştirin. Bir set slayta aktin enterferans yapan bir ilaç ekleyin ve inkübe edin.

Yapışan hücreler çoğalır, yayılır ve alttaki fibronektin adalarının şeklini alırken, hücre tek tabakasını sınırlayan uzamsal ipuçlarına yanıt olarak aktin liflerini yeniden düzenler ve önyargılı hizalamayı teşvik eder.

Şimdi, hücre fiksasyonu için slaytları paraformaldehit ile tedavi edin. Faz kontrast mikroskobu altında, halka mikro desenleri üzerindeki hücreler, tercihli önyargılarına göre hizalanmış parlak konturlara sahip koyu bölgeler olarak görünür.

Yazılımı kullanarak, her hücrenin hizalama açısını halkanın çevresel yönünden sapma olarak hesaplayın. Memeli hücre kiralitesini belirlemek için ortalama. Aktin enterferans yapan ilaçla tedavi edilen hücreler ters kiralite sergileyebilir.

Hücreleri tohumlamadan önce, ortamı ve tripsini 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosunda ısıtın.

Daha iyi hücre bağlanması için, desenli slaytı kültür ortamı içeren 12 oyuklu bir plakaya batırın ve inkübatörde 37 santigrat derecede ısıtın. Hücreler tripsinlendikten sonra, hücreleri FBS içeren ortamla nötralize edin. Hücreleri 3 dakika boyunca 100 x g'da peletleyin ve ardından hücre peletini taze ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve mililitre başına 200.000 hücre konsantrasyonunu elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin.

Bir altın slayt içeren her oyuğa 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre bağlanması için 15 dakika inkübe etmeden önce, düzgün hücre tohumlaması için plakayı birkaç kez hafifçe sallayın. 15 dakika sonra, hücre ekini mikroskop altında kontrol edin ve gerekirse bir süre daha inkübe edin.

Hücreler bağlandıktan sonra, her bir oyuktan bağlanmamış hücreler içeren ortamı aspire edin ve 1 mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Hücreleri inkübatörde 24 saat boyunca kültürleyin ve kiralitenin oluşup oluşmadığını belirlemek için birleşmeyi kontrol edin.

Gerekli birleşme sağlandığında, kültür ortamını çıkararak hücreleri sabitleyin. PBS ile bir kez duruladıktan sonra, slayta% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve PBS ile üç kez tekrar durulamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Görüntüleri elde etmek için kamera işlevine sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanın ve slayttaki her halkayı yüksek çözünürlükte yakalayın.

Kiralite karakterizasyonu için MATLAB kod dosyalarını indirin. Kod klasörünü ve alt klasörleri MATLAB yoluna ekleyin ve "ROI_selection.m" dosyasını açın. 4. satırda, dizini istediğiniz veri klasörüne değiştirin.

14. satırdaki görüntü boyutunu, ilk iki şekil halkanın iç daire boyutunu, diğer ikisi ise dış daireyi temsil edecek şekilde değiştirin.

Faz kontrast görüntülerinde ilgilenilen bölgeyi veya ROI'yi belirlemek için, Çalıştır düğmesine tıklayarak "ROI_selection.m" m MATLAB kodunu çalıştırın. Seçim karesini halkaya sığacak şekilde manuel olarak sürükleyin, ardından seçimi onaylamak için resme çift tıklayın.

Klasördeki tüm görüntülerden ROI'yi seçtikten sonra, her görüntü için ROI bilgilerini depolamak için bir ".mat" dosyası oluşturulacaktır. Ardından, "Analysis_batch.m" dosyasını açın ve daha önce gösterildiği gibi klasörün dizinini değiştirin. Birden fazla hücresel halka modelinin kiralitesini belirlemek için "Analysis_batch.m" kodunu çalıştırmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.

Her halka için dairesel istatistiklerin yanı sıra saat yönünde, kiral olmayan ve saat yönünün tersine halkaların sayılarını içeren bir "datatoexcel.txt" dosyası oluşturulacaktır.