Üç odacıklı dizi tabanlı empedans testi: elektrik empedansını ölçerek kanser hücrelerinin invaziv potansiyelini değerlendirmek için gerçek zamanlı bir analiz tekniği

Kanserle ilişkili stromal hücreler, doku bazal zarında bulunan metastatik tümör hücrelerini tetikleyebilen kimyasal faktörler salgılar. Sonuç olarak, kanser hücreleri bazal zarı istila eder ve dokunun hücre dışı boşluğuna doğru göç eder.

Kanser hücrelerinin invaziv kapasitesini in vitro olarak ölçmek için, birden fazla üç odacıklı diziye sahip çok kuyulu bir plaka ile başlayın. Her dizide, alt bölme yapışık bir stromal hücre kültürüne sahiptir. Bir hücrenin elektriksel aktivitesini ölçen minyatür elektrotlar olan kaynaşmış empedans ölçen mikroelektrotlara sahip üst oda, elektrotların üzerinde bulunan hücre dışı matris kaplı mikro gözenekli zara yapışan kanser hücreleri ile kaplanır.

Empedans bazlı bir analizör üzerinde inkübasyon sırasında, stromal hücreler, kanser hücrelerine doğru hareket eden ortama kemotaktik faktörler salar. Bu faktörler, orta odanın alt tarafında bulunan yarı geçirgen zardan geçer.

Stromal hücre tarafından salgılanan faktörler, yapışık kanser hücrelerine invaziv fenotiplere dönüşmeleri için sinyal verir. Yanıt olarak, istilacı hücreler mikro gözenekli zardan geçerek zarın karşı tarafındaki iç içe geçmiş elektrotlara ulaşır.

Zamanla, daha fazla kanser hücresi elektrotlara yapıştıkça, hücresel empedansa neden olurlar - hücreler tarafından akım akışının engellenmesi. Hücresel empedansın ölçümü, kanser hücrelerinin istilacı potansiyelinin bir göstergesidir.

Üç steril odayı da doku kültürü başlığına yerleştirin. Alt haznenin kısa tarafındaki düğmeyi bulun ve alt hazneyi, düğme deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.

90 mikrolitre ortamda 30.000 ila 50.000 hücreyi, herhangi bir kabarcık oluşturmadan alt odadan her bir oyuğa ekleyin. Hücre motilitesi için pozitif kontrol olarak iki alt odacıkta fetal sığır serumu takviyeli ortamın %5'ini kullanın ve negatif kontrol olarak %0 serum takviyeli ortam kullanın.

Kaputta 10 ila 15 dakika oturmasına izin verdikten sonra alt hazneyi 90 derece döndürün. Ardından, orta bölmeyi üstüne yerleştirin, böylece alt bölmedeki düğme orta bölmedeki çentiğe kayar. Düzeneğin uzun kenarlarının her birinden bir tık sesi duyulana kadar hazneyi dikey olarak aşağı doğru itin.

Orta haznenin tüm kuyucuklarına 160 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin. Kuyucuklar doldurulduktan sonra kubbe şeklinde bir menisküsün göründüğünden emin olun ve orta ve üst odacıklardaki mavi noktaları hizalamak için elektrotlar aşağı bakacak şekilde üst odayı orta bölmeye yerleştirin. Düzeneğin uzun kenarlarının her birinden bir tık sesi duyulana kadar hazneyi dikey olarak aşağı doğru itin.

Üst hazneye 20 ila 50 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin. Düzeneği, doku kültürü inkübatöründeki çift amaçlı hücre analizörüne monte edin ve arka planı ölçmeden önce 30 dakika bekleyin.

Hücre analizörü yazılımını açın, ardından kullanılacak yuvayı seçin, ardından 'Mesaj' sekmesine tıklayın ve dizinin yuvaya iyi yerleştirildiğinden ve elektrotların sensörlerle iyi hizalandığından emin olmak için 'Bağlantılar Tamam' yazdığından emin olun.

'Deney Notları' sekmesine tıklayın ve deneyle ilgili tüm olası bilgileri doldurun. Ardından, 'Düzen' sekmesine tıklayın ve dizi düzeninin açıklamasını doldurun. Ardından, 'Program' sekmesine tıklayın ve 'Adımlar' menüsünden iki adım ekleyin; bir tarama içeren bir arka plan adımı ve 100 tarama içeren bir test adımı.

Dizi, çift amaçlı hücre analizörü inkübatöründe 30 dakika kaldıktan sonra, arka plan ölçümünü başlatmak için 'Oynat' düğmesine tıklayın.

Arka plan ölçümü yapıldıktan sonra, diziyi yuvadan çıkarın ve hücre kültürü başlığına geri yerleştirin. Daha sonra, üst haznenin her bir oyuğuna 100 mikrolitre serumsuz ortamda 30.000 ila 50.000 hücre ekleyin. Bunlar, elektrotun zardan başarılı bir şekilde geçtikten sonra algılayacağı hücrelerdir.

Empedans ölçümü için çift amaçlı hücre analizörüne monte etmeden önce düzeneğin davlumbazda 30 dakika

Diziyi çift amaçlı hücre analizörüne geri yerleştirin ve 'Mesajlar' sekmesinde 'Bağlantılar Tamam' mesajı olup olmadığını kontrol edin. Empedans ölçümünü başlatmak için 'Oynat' düğmesine tıklayın ve ardından sinyalin ilerlemesini izlemek için 'Çizim' sekmesine tıklayın.

Uç noktaya 25 saatten önce ulaşılırsa, 'Yürüt' açılır menüsünden 'İptal' adımına tıklayın. Verileri dışa aktarmak için grafiğe sağ tıklayın, liste biçiminde 'Kopyala'yı seçin ve ardından verileri bir elektronik tabloya yapıştırın.