Sitrat Sentaz Aktivite Testi: Drosophila Doku Homojenatında Mitokondriyal Sitrat Sentaz Aktivitesini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Test

Mitokondri içinde, iç mitokondriyal zarın matrisinde lokalize olan sitrat sentaz, sitrik asit döngüsünün ilk adımı olan sitrat oluşturmak için asetil koenzim A ile oksaloasetik asit arasındaki reaksiyonu katalize eden hız sınırlayıcı enzimdir.

Sitrat sentaz aktivitesini analiz etmek için, mitokondride bol miktarda bulunan yetişkin Drosophila sinek torakslarını, etilendiamintetraasetik asit, EDTA ve iyonik olmayan bir deterjan içeren soğutulmuş bir ekstraksiyon tamponu ile doldurulmuş bir tüpe aktarın.

Isı aracılı protein denatürasyonunu önlemek için toraks dokularını buz üzerinde homojenize edin. Uygulanan kesme kuvveti, deterjanlarla birlikte dokuyu parçalar ve mitokondri dahil olmak üzere hücre içi bileşenleri serbest bırakır.

Ayrıca, iç mitokondriyal zarın yırtılması, sitrat sentaz dahil olmak üzere mitokondriyal matris proteinlerinin salınmasına yol açar. EDTA, iki değerlikli katyonlara bağlanır ve proteaz aktivitesini inhibe eder, böylece protein bozulmasını önler.

Homojenatı ekstraksiyon tamponu kullanarak seyreltin ve çok kuyulu plakanın kuyucuklarını içeren reaksiyon karışımına uygun bir hacim ekleyin. Reaksiyon karışımı, asetil koenzim A, oksaloasetik asit ve ditionitroben