JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:44 dk. • July 8th, 2025
Mitokondri içinde, iç mitokondriyal zarın matrisinde lokalize olan sitrat sentaz, sitrik asit döngüsünün ilk adımı olan sitrat oluşturmak için asetil koenzim A ile oksaloasetik asit arasındaki reaksiyonu katalize eden hız sınırlayıcı enzimdir.
Sitrat sentaz aktivitesini analiz etmek için, mitokondride bol miktarda bulunan yetişkin Drosophila sinek torakslarını, etilendiamintetraasetik asit, EDTA ve iyonik olmayan bir deterjan içeren soğutulmuş bir ekstraksiyon tamponu ile doldurulmuş bir tüpe aktarın.
Isı aracılı protein denatürasyonunu önlemek için toraks dokularını buz üzerinde homojenize edin. Uygulanan kesme kuvveti, deterjanlarla birlikte dokuyu parçalar ve mitokondri dahil olmak üzere hücre içi bileşenleri serbest bırakır.
Ayrıca, iç mitokondriyal zarın yırtılması, sitrat sentaz dahil olmak üzere mitokondriyal matris proteinlerinin salınmasına yol açar. EDTA, iki değerlikli katyonlara bağlanır ve proteaz aktivitesini inhibe eder, böylece protein bozulmasını önler.
Homojenatı ekstraksiyon tamponu kullanarak seyreltin ve çok kuyulu plakanın kuyucuklarını içeren reaksiyon karışımına uygun bir hacim ekleyin. Reaksiyon karışımı, asetil koenzim A, oksaloasetik asit ve ditionitrobenzoik asit içerir.
Homojenat içindeki sitrat sentaz, oksaloasetik asit ve asetil koenzim A arasındaki reaksiyonu katalize ederek bir tiyol grubu ile sitrat ve koenzim A oluşturur. Tiyol grubu, renksiz ditionitrobenzoik asit ile reaksiyona girerek sarı bir ürün olan tiyonitrobenzoik asit oluşturur.
Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, sarı renkli çözeltinin emilimini ölçün. Absorbans, doku homojenatındaki sitrat sentaz aktivitesi ile ilişkili olabilir.
10 yetişkin sinek göğüs kafesini hemen 100 mikrolitre buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponuna aktarın ve buz üzerinde bir havaneli ile homojenize edin. Buz üzerinde beş ila 10 saniye homojenize ederek, beş saniye buz üzerinde bekleterek ve ardından tüm dokular tamamen homojenize olana kadar tekrarlayarak numuneleri soğuk tutun.
Protein içeriği ölçümü için her homojenize numuneden 10 mikrolitre alarak yeni bir tüpe koyun ve bu tüpleri de buz üzerinde tutun. Toplam 500 mikrolitre hacim için kalan her numuneye 400 mikrolitre buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
Her reaksiyon için, taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisinin 150 mikrolitresine 1 mikrolitre seyreltilmiş hücre lizatı ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, 25 santigrat derecede dört dakika boyunca her 10 ila 30 saniyede bir 412 nanometrede absorbansı ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
Verileri zaman içinde absorbans olarak çizin, ardından eğrinin doğrusal kısmı için eğimi hesaplayın. Son olarak, sitrat sentaz aktivitesini normalleştirmek için reaksiyon hızını veya eğimi numune protein konsantrasyonuna bölün.