JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:03 dk • July 8th, 2025
Dokuda, çeşitli metabolik süreçler için çok önemli bir mineral olan demir, normalde hemoproteinlere ve hem olmayan demir proteinlerine bağlı olarak bulunur. Hemoproteinler, porfirin halkalarına bağlı demir veya hem demir içerirken, hem olmayan demir proteinleri porfirin halka yapısından yoksundur ve çoğunlukla ferrik veya hem olmayan demir içerir.
Fare karaciğer dokusundaki hem olmayan demir içeriğini tahmin etmek için, kurutulmuş, hasat edilmiş bir fare karaciğer dokusu parçasını düşük konsantrasyonlarda hidroklorik asit ve trikloroasetik asit ile tedavi edin. Dokuyu sindirmek ve asit kaynaklı protein çökelmesini kolaylaştırmak için yüksek sıcaklıklarda inkübe edin.
Düşük asit konsantrasyonları nedeniyle, hem olmayan demir, ilişkili proteinlerden salınır. Porfirin halkasına bağlı olan heme demiri etkilenmeden kalır.
Soğuduktan sonra, hem olmayan demir içeren istenen süpernatan hacmini çok kuyulu bir plakaya aktarın. Bir indirgeyici ajan olan tiyoglikolik asit ile desteklenmiş kromojenik demir şelatörü, batofenantrolin sülfonat, BPS'yi uygun tampona ekleyin ve inkübe edin.
Tiyoglikolik asit, tüm ferrik hem olmayan demiri, BPS'ye 1:3 oranında kolayca bağlanabilen ve oldukça kararlı, pembe renkli bir kompleks oluşturan demirli demire indirger. Ek olarak, tiyoglikolik asit, BPS ile etkileşime girebilecek bakır gibi herhangi bir kirletici iki değerlikli metal katyonundan kaynaklanan paraziti önler.
Fare karaciğer dokusu fragmanındaki hem olmayan demir konsantrasyonunu temsil eden pembe demirli-BPS komplekslerinin emilimini ölçmek için çok kuyulu plakayı bir mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.
Kurutulmuş her doku parçasını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 1 mililitre asit karışımı ekleyin ve kapatın. Aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın, ancak doku burada atlanır.
Dokuyu sindirmek için tüpleri 65 santigrat derecede 20 saat inkübe edin.
Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 500 mikrolitre berrak asit ekstraktını yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için plastik uçlarla donatılmış bir mikropipet kullanın.
Kromojen reaksiyonlarını doğrudan düz tabanlı, 96 oyuklu, berrak, işlenmemiş, polistiren mikroplakalara hazırlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
Deiyonize su referansına karşı 535 nanometre dalga boyunda bir plaka okuyucuda numune absorbansını ölçün.