Rezorpsiyon Çukuru Deneyi: Kalsiyum Fosfat Kaplı Kültür Plakaları Kullanılarak Olgun Osteoklastların Kalsiyum Rezorpsiyon Aktivitesini Ölçmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Osteoklastlar, çok çekirdekli makrofajlar, kemik rezorpsiyonunu kolaylaştırır - kemik dokusunun parçalanması ve kemik minerallerinin salınması.

Osteoklast rezorpsiyonunu in vitro olarak ölçmek için, osteoklast progenitör hücrelere farklılaşma ve bağlanma için ortam içeren makrofaj koloni uyarıcı faktör M-CSF'de insan periferik kan mononükleer hücrelerini kültürleyin. Osteoklast progenitörlerini ve santrifüjü hasat edin.

M-CSF ve nükleer faktör kappa-Β ligandının reseptör aktivatörü RANKL ile desteklenmiş ortamda yeniden süspansiyon halindeki süspansiyonu, inorganik kemik bileşenini taklit eden kalsiyum fosfat ile kaplanmış çok kuyulu plaka kuyucuklarına pipetleyin. M-CSF ve RANKL, osteoklast progenitör farklılaşmasına ve osteoklastlara füzyona neden olarak rezorpsiyonu aktive eder.

Aktive edilmiş osteoklastlar, kalsiyum fosfat kaplamaya yapışır, hücre iskeletlerini aktin açısından zengin bir sızdırmazlık bölgesi oluşturacak şekilde yeniden düzenler ve proton ve asit hidrolazları salgılayan fırfırlı sınırlar geliştirir. Elde edilen asidik ortam, kalsiyum fosfat kaplamasını çözerek kalsiyum ve fosfat iyonlarını serbest bırakır ve bir emilim çukuru oluşturur.

Kuluçka sonrası, çözünmüş iyonları uzaklaştırarak kuyuları yıkayın. Sonraki boyama için osteoklastları sabitleyin ve geçirgen hale getirin. Aktin filamentlerini uygun bir boya ile boyayın. Çekirdekleri DNA bağlayıcı bir boya ile boyayın. Kuyu kaplamasındaki kalsiyumu kalsiyum bağlayıcı bir boya ile boyayın.

Floresan mikroskobu altında, fonksiyonel osteoklastlar, rezorptif fonksiyon için çok önemli olan çok sayıda floresan çekirdeği ve aktin halkaları sergiler. Rezorpsiyon çukurları, aktin halkaları tarafından kaplanmış floresan kalsiyum fosfat kaplama üzerinde siyah alanlar olarak görünür.

Uygun yazılım kullanarak, osteoklastik rezorpsiyonu belirleyerek çukur alanını ölçün.

PBMC'leri 20 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör içeren tam bir alfa-MEM içinde yeniden askıya alın ve bir şişede 2.5 x 10⁵ hücre / cm² PBMC'leri tohumlayın. Kalsiyum fosfat kaplı plakaları 50 mikrolitre fetal sığır serumu ile 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Daha sonra, osteoklast öncülerini ölü veya yapışık olmayan hücrelerden ayırmak için şişeyi PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, 75^cm2 şişeye 4 mililitre tripsin ekleyin. 30 dakika sonra, 4 mililitre tam alfa-MEM ekleyerek sindirimi durdurun. Ardından, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri dikkatlice ayırın.

Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir sayma odası kullanarak toplam hücre sayısını sayın. Hücreleri peletlemek için tüpü yedi dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve 1 x 10⁶ hücre / mL elde etmek için peleti M-CSF ve RANKL içeren tam alfa-MEM içinde yeniden süspanse edin.

Fetal sığır serumunu kalsiyum fosfat kaplı plakadan aspire edin ve oyuk başına 200 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. İnkübasyondan sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve tekrar PBS ile yıkayın.

Boyama için, sabit hücrelere geçirgenlik tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin.

Aktin filamentlerini boyamak için, hücreleri PBS'de 100 mikrolitre AlexaFluor 546 etiketli falloidin çözeltisi ile 30 dakika inkübe edin. Ardından, boyama solüsyonunu aspire edin ve çekirdekleri 10 dakika boyunca 100 mikrolitre Hoechst kullanarak boyayın.

Kalsiyum fosfat kaplamayı PBS'de 100 mikrolitre 10 mikromolar kalsein ile 10 dakika boyunca boyayın. PBS ile üç kez yıkadıktan sonra görüntü yakalayın.