Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Bazı hücresel proteinlerin fosforilasyonu, biyolojik işlevleri için önemlidir.

Tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak bozulmamış proteinlerin fosforilasyon seviyelerini ölçmek için, ızgara dizisi desenli bir cam lamel alarak başlayın. Her bölme, protein bağlanması sırasında sterik tıkanıklığı önlemek için normal PEG ile aralıklı biyotinile polietilen glikol veya PEG bazlı bağlayıcılar ile kaplanmıştır.

Analizde otofloresanı en aza indirmek için lamel indirgeyici bir reaktif ile muamele edin. Lameli Neutravidinler - biyotin bağlayıcı proteinler - ile kaplayın ve inkübe edin, böylece biyotinile edilmiş PEG bağlayıcılarını bağlamalarına izin verin.

Diziyi spesifik anti-hedef protein antikorları ile destekleyin. Her antikor, antikorun nötravidine bağlanmasına yardımcı olan ve immobilizasyona neden olan Fc bölgesine bağlı biyotin içerir.

Şimdi, hedef proteinin yeşil floresan etiketli fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş varyantları dahil olmak üzere çeşitli proteinler içeren hücre kültürü lizatını ekleyin ve inkübe edin. Hedef proteinin her iki varyantı da antikorlar tarafından yakalanır ve kompleksler oluşturur. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için yıkayın.

Daha sonra, bu