Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Bazı hücresel proteinlerin fosforilasyonu, biyolojik işlevleri için önemlidir.

Tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak bozulmamış proteinlerin fosforilasyon seviyelerini ölçmek için, ızgara dizisi desenli bir cam lamel alarak başlayın. Her bölme, protein bağlanması sırasında sterik tıkanıklığı önlemek için normal PEG ile aralıklı biyotinile polietilen glikol veya PEG bazlı bağlayıcılar ile kaplanmıştır.

Analizde otofloresanı en aza indirmek için lamel indirgeyici bir reaktif ile muamele edin. Lameli Neutravidinler - biyotin bağlayıcı proteinler - ile kaplayın ve inkübe edin, böylece biyotinile edilmiş PEG bağlayıcılarını bağlamalarına izin verin.

Diziyi spesifik anti-hedef protein antikorları ile destekleyin. Her antikor, antikorun nötravidine bağlanmasına yardımcı olan ve immobilizasyona neden olan Fc bölgesine bağlı biyotin içerir.

Şimdi, hedef proteinin yeşil floresan etiketli fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş varyantları dahil olmak üzere çeşitli proteinler içeren hücre kültürü lizatını ekleyin ve inkübe edin. Hedef proteinin her iki varyantı da antikorlar tarafından yakalanır ve kompleksler oluşturur. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için yıkayın.

Daha sonra, bu kompleksleri, proteinin fosforile kalıntılarını özel olarak bağlayan ve komplekse farklı bir floresan sinyali veren ikinci kırmızı floresan etiketli antikor seti ile tedavi edin.

Diziyi bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin ve iki farklı floresan sinyali olup olmadığını gözlemleyin. Her iki floresan sinyalinin kolokalizasyonu, numunede fosforile proteinlerin varlığını gösterir.

Biotin-PEG işlevselleştirilmiş dizilerini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına dengeleyin. Lameli dizi yukarı bakacak şekilde, sızdırmazlık filmi ile kaplı 100 milimetrelik bir doku kültürü kabının üzerine yerleştirin. Dizinin her bir karesini mililitre başına 10 miligram sodyum borohidrür ve PBS ile oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, T50'de mililitre başına 0.2 miligram NeutrAvidin ile 5 dakika inkübe edin, ardından T50-BSA ile üç kez yıkayın. İnkübasyonu, T50-BSA'da mililitre başına 2 mikrogram biyotinile POI'ye özgü antikor ile 10 dakika boyunca tekrarlayın, ardından yıkayın.

İlk olarak, lizatı pipetleyerek çözün ve karıştırın. 1 mikrolitre lizatı 100 mikrolitre buz gibi soğuk T50-BSA/PPI ile seyreltin. Lizatı dizi üzerinde 10 dakika inkübe edin, ardından yıkayın. Buz gibi T50-BSA / PPI'de AF647 konjuge anti-fosfotirozin antikoru hazırlayın ve dizi üzerinde 1 saat inkübe edin.

Hedefe bir damla yağ bırakın. Nanogrid'i görüntüleme için sahneye yerleştirin. İletilen beyaz ışığı kullanarak ızgara desenine odaklanın. Izgaranın 20 görüntüsünden oluşan bir dizi elde edin. Piksellerin doygun olmadığından emin olun ve görüntü serisini "Güvenilir" olarak kaydedin.

Havadar bir desen oluşturmak için nanogrid'in odağını bozun. Kazanç kalibrasyonları için 20 görüntüden oluşan bir seri elde edin ve görüntüyü "Kazanç" olarak kaydedin. Ardından, kameraya gelen tüm ışığı engelleyerek kamera ofseti için 20 görüntüden oluşan bir dizi elde edin ve görüntüyü "Arka Plan" olarak kaydedin.

SiMPull görüntülerini elde etmek için önce yağ objektifini temizleyin ve objektif üzerine ilave yağ bırakın. Lamel dizisini mikroskop tablasına sabitleyin. Her numune için önce uzak kırmızı kanalda, ardından daha düşük dalga boylu floroforlarda görüntüler elde edin. Tampon seviyesini her 30 ila 45 dakikada bir kontrol edin ve gerektiğinde yenileyin.