Kültürlenmiş Hücrelerde Substrat Oksidasyon Deneyi: Hapsolmuş CO2'den Radyoaktif Sinyalleri Ölçerek Hücrelerde Substrat Oksidasyonunu Ölçmek İçin Bir İn Vitro Test

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 4:25 dk • July 8th, 2025

Metabolik olarak aktif hücrelerde, karbon içeren substratlar, enerji üretmek ve bir yan ürün olarak karbondioksiti serbest bırakmak için bir dizi biyokimyasal reaksiyon yoluyla oksitlenir.

Substrat oksidasyon oranını belirlemek için, istenen farklılaşmamış hücrelerin yapışık bir kültürü ile başlayın. Hücreleri, omurgasında on dört radyoaktif karbon içeren uygun bir substrat ile bir ortamda destekleyin ve inkübe edin.

Hücreler substratı tüketir ve hücrelerden çevredeki ortama yayılan radyoaktif işaretli karbondioksiti serbest bırakmak için oksitler.

Reaksiyonu söndürmek için bu ortamı perklorik asit içeren bir gaz tutucu tertibatına aktarın. Bu tüp, tüp kapağının içine yerleştirilmiş sodyum hidroksite batırılmış bir filtre kağıdı içerir. Kapağı kapatın ve inkübe edin.

Kuluçka sırasında, gaz halindeki karbondioksit tüpün içine salınır. Sodyum hidroksit, radyoaktif işaretli karbon dioksiti emerek filtre kağıdına hapseder. Bu filtre kağıdını bir sintilasyon kokteyli içeren bir şişeye aktarın ve sıvı sintilasyon sayacının içine yerleştirin.

Tezgahın içinde, radyoaktif işaretli karbon, yüksek enerjili beta parçacıkları yayarak radyoaktif bozunmaya uğrar. Bu parçacıklar, sintilasyon kokteylinin bileşenleri tarafından emilir ve sintilasyon sayacı tarafından hesaplanan ışık darbeleri yayar.

Tespit edilen radyoaktivite miktarı, hücrelerdeki substrat oksidasyon oranı ile ilişkilidir.

Hücreleri ekstra kuyucuklarda DPBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın. DPBS'de 20 mikrolitre sindirilmiş hücreyi 20 mikrolitre akridin portakalı ve propidyum iyodür boya çözeltisi ile yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin ve sayıyı kaydedin.

Tahlil kuyucuklarındaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. RAM tarafından belirlenen doku kültürü başlığında her bir tahlil kuyusuna 500 mikrolitre sıcak ortam ekleyin. Plakayı parafilm ile kapattıktan sonra, hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede RAM tarafından belirlenmiş bir inkübatörde inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, filtre kağıdını 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünün kapağının içindeki alandan biraz daha büyük dairesel parçalar halinde kesin ve kağıdı kapağa sıkıca yerleştirin. Her tüpe 200 mikrolitre 1 molar perklorik asit ve kapağın içine takılan filtre kağıdına 20 mikrolitre sodyum hidroksit ekleyin.

Hücreleri inkübe ettikten sonra, her bir oyuktan 400 mikrolitre kültür ortamını hazırlanan tüplere aktarın ve kapakları hemen kapatın. Tüpleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir tüp rafında bırakın.

Paralel olarak, inkübasyon sırasında, her tüp için bir sintilasyon şişesi ayarlayın ve 4 mililitre sintilasyon sıvısı ile doldurun. Her bir filtre kağıdı parçasını bir parıldama şişesine aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Olası RAM kontaminasyonu için doku kültürü başlığı, su banyosu, buzdolabı, inkübatör, lavabo, zemin ve diğer çalışma alanlarında silme testleri yapın. Kağıt mendilleri sintilasyon sıvısı içeren parıldama şişelerine koyun.

Bir sintilasyon sayacı ile sintilasyon şişelerindeki karbon-14 radyoaktivitesini ölçün ve okuma sonuçlarını kaydedin. Gerekirse çalışma ortamını radyasyon güvenliği yönergelerine göre dekontamine edin.

12:11

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:01

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:24

İzole Çalışma Sıçan Kalp Glukoz ve Yağ Asidi Oksidasyonu Oranlarının Belirlenmesine Yöntemleri

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:20

XTT Testi: Hücre Canlılığını ve Mitokondriyal Aktiviteyi Değerlendirmek için Kolorimetrik Bir Test

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:28

Floresan Prob Görüntüleme Testi: Reaktif Oksijen Türleri İndükleyici ile Tedavi Edilen Kültürlenmiş Bağırsak Organoid Hücrelerinde Oksidatif Stresi Görselleştirmek İçin Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:44

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:10

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:17

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:03

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:43

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026