JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:02 dk. • July 8th, 2025
Septinler, kavisli plazma zarı yüzeylerine bağlanan anahtar hücre iskeleti proteinleridir.
Mikroküreler üzerinde in vitro septin düzeneğini gözlemlemek için, önce iki tabaka oluşumu için katı destek görevi gören düzgün boyutlu, mikroskobik silika boncukların bir süspansiyonunu alın. Herhangi bir boncuk kümesini kırmak için bu süspansiyonu girdaplayın.
Küçük unilamellar veziküller, SUV'lar - tek bir lipit çift tabakası ile çevrili küresel veziküller ile destekleyin. Mikro kürelerin çökelmesini önleyerek sürekli çalkalama ile inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, dış kutup kafa grupları, SUV'ların hidrofilik mikroküre yüzeyine adsorpsiyonunu kolaylaştırır. Bu etkileşim, SUV'ların yırtılmasına neden olur, ardından SUV lipidlerinin sürekli bir tabaka olarak kavisli mikroküre yüzeyine füzyonu gerçekleşir ve bu da küresel, desteklenen bir lipid çift tabakası, SLB oluşumu ile sonuçlanır.
Fazla bağlanmamış lipidleri çıkarmak için yıkayın ve reaksiyon tamponunda yeniden süspanse edin. Spesifik olmayan adsorpsiyonları önlemek için küresel SLB süspansiyonunu polietilen glikol kaplı bir yüzeyin küçük bir bölgesine aktarın. Odaya floresan etiketli bir septin süspansiyonu ekleyin ve inkübe edin.
Septinler, küresel SLB'lerin pozitif eğriliğini tanıyan ve filamentler oluşturmak üzere polimerize olan hetero-oligomerler oluşturur. Sonunda, septin filamentleri birbirleriyle etkileşime girerek daha yüksek dereceli yapıların oluşumuna yol açar.
Septin kaplı SLB'leri yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Floresan varlığı, septinin eğriliğe duyarlı birikimini gösterir.
İlk olarak, silika mikroküreler içeren şişeyi 15 saniye boyunca girdaplayın. Ardından, bir dakika boyunca banyo sonikasyonu yapın ve herhangi bir kümeyi kırmak için 15 saniye boyunca tekrar girdap yapın. Boncukları SLBB ve 10 mikrolitre 5 milimolar SUV ile düşük yapışma özelliğine sahip bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.
Boncuk-lipit karışımını oda sıcaklığında, çökelmeyi önlemek için bir çalkalayıcı üzerinde bir saat inkübe edin. Bu arada, PEGile edilmiş bir lamel çözün ve üzerine kesilmiş 0,2 mililitrelik bir PCR tüpü yapıştırın. İnkübasyondan sonra, boncukları belirlenen RCF'de 30 saniye santrifüjleyin.
İlk sıkmadan sonra 50 mikrolitre süpernatan çıkarın. Daha sonra 200 mikrolitre PRB ekleyin ve kuvvetli pipetleme ile karıştırın. Sonraki turlar için 200 mikrolitre PRB'yi çıkarın ve ikinci ve üçüncü dönüşten sonra 200 mikrolitre daha ekleyin ve dördüncü dönüşten sonra 220 mikrolitre PRB ekleyin.
Birden fazla boncuk boyutuna sahip bir yarışma testi yapıyorsanız, her boncuk boyutundan eşit hacimleri karıştırarak ve bu boncuk karışımının 29 mikrolitresini 721 mikrolitre reaksiyon tamponu ile seyrelterek reaksiyonu hazırlayın. Daha sonra 75 mikrolitre seyreltilmiş boncuk ve 25 mikrolitre SSB'de seyreltilmiş proteini kuyucuklara ekleyin ve karıştırın.
Septinler sabit bir durumda ölçülüyorsa, karışımı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve ardından TIRF'ye yakın veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.