Küçük Moleküllü Nematisit Tarama Deneyi: Potansiyel Nematisitleri Ditylenchus dipsaci'ye Karşı Taramak İçin Orta Verimli Bir Yöntem

Ditylenchus dipsaci gibi bitki paraziti nematodlar mikroskobik solucanlardır. Canlı solucanlar, kas kasılmaları yoluyla sinüzoidal hareketler sergilerler ve motiliteleri, kültür koşullarında sağlıklarının önemli bir belirleyicisidir.

Nematisitlere maruz kalma - kimyasal toksik maddeler, bu kültürlenmiş nematodların hareketliliğini etkileyen ve ölümlerine yol açan temel biyolojik süreçlere müdahale edebilir.

Küçük moleküllü nematisitleri taramak için, damıtılmış su içeren, çok kuyulu bir plaka alın. Temiz bir sabitleme aleti kullanarak, her bir oyuğa tutarlı miktarlarda molekül transferini sağlamak için potansiyel küçük moleküler nematisitleri kimyasal stok plakasından tahlil plakasına aktarın.

Plakanın her bir oyuğuna eşit sayıda nematod dağıtın. Nematodun hayatta kalmasını ve hareketliliğini desteklemek için nemli koşulları korurken plakaları kapatın. Solucanların yerleşmesini önlemek için plakayı hafif çalkalama ile inkübe edin.

Kuluçka sırasında, çeşitli toksik küçük moleküller solucanlara etki eder ve onları öldürürken, toksik olmayanların hiçbir etkisi yoktur. Hareketsiz bir solucan popülasyonuna sahip kuyuları belirlemek için plakayı diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin.

Tahlil plakalarını sodyum hidroksit çözeltisi - son nokta kimyasal uyarıcı ile destekleyin. Bu, dinlenen solucanların hareketini tetikler ve onları ölü olanlardan ayırır.

Bazı kuyucuklarda sodyum hidroksit işleminden sonra hareketsiz solucanların varlığı, karşılık gelen küçük moleküllerin nematisitler olarak etkinliğini doğrular.

Tahlil plakalarını hazırlamak için, otoklavlanmış damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve çok kanallı bir pipet ile düz tabanlı, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna oluktan 40 mikrolitre damıtılmış su dağıtın. 96 oyuklu kimyasal stok plakalarından kimyasalları, kimyasal plakaya üç kez sabitleyerek tahlil plakalarına ekleyin. Ardından, pimleri 10 kez test plakasına aktarın. Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda kurulayın.

Koleksiyondaki nematod sayısını saymak için, önce koleksiyonu yeniden askıya alın ve ardından, düşük tutma noktalı uçlar kullanarak 5 mikrolitre çözeltiyi bir slayt üzerine pipetleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak 5 mikrolitredeki nematod sayısını sayın. Ardından, steril damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu mikrolitre başına iki solucan olarak ayarlayın.

Daha sonra, çok kanallı bir pipet ve bir oluk ile 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 10 mikrolitre numune ekleyin. Plakaları nemli bir kağıt havluyla sarın ve bir kutuya koyun. Ardından, plakaları stabilize etmek ve minimum hareket etmesini sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyin ve 20 santigrat derece sallanan bir inkübatörde 200 rpm'ye ayarlanmış yapışkan bir ped üzerine yapıştırın.

Plakaları 5. günde diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. DMSO çözücü kontrollerinde ve ilaçla tedavi edilmiş kuyucuklarda mobil ve toplam D. dipsaci sayısını sayın.

Solucanlar hareketsizse, hareketi uyarmak için kuyuya 40 milimolar nihai konsantrasyona 2 mikrolitre 1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Mobil solucanların oranını hesaplayın. D. dipsaci eleklerinde, tekrarlanabilir şekilde %0 mobil solucan veren kuyular güçlü isabetler olarak kategorize edilir.