JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:08 dk • July 8th, 2025
Anjiyogenez, gelişimsel ve patolojik durumlar sırasında mevcut kan damarlarından yeni kan damarlarının oluşmasıdır. Kan damarlarının iç yüzeyini kaplayan endotel hücreleri ile çevredeki perisitler - kan damarlarının dış tarafındaki destekleyici hücreler - arasındaki geniş iletişim, anjiyogenez için çok önemlidir.
İn vitro anjiyogenezi incelemek için, bir fibrinojen çözeltisi içinde süspanse edilmiş endotel hücreleri ve perisit kaplı mikro taşıyıcı boncuklarla başlayın - bir fibrin öncüsü olarak işlev gören çözünür bir glikoprotein.
Şimdi, boncuk süspansiyonunu bir proteolitik enzim olan trombin çözeltisi içeren bir kültür plakasına pipetleyin ve inkübe edin. Trombin fibrinojen molekülüne bağlanır ve bölünmesinin çözünmeyen fibrin monomerleri oluşturmasına neden olarak polimerik fibrin jeli oluşturur. Bu adım, hücre kaplı boncukların fibrin jeli içine gömülmesini sağlar.
Daha sonra, fibrin jelin üzerine bir fibroblast kültürü - bağ dokusu öncü hücreleri - yerleştirin ve fibroblastların aktivasyonuna izin vermek için inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, fibroblastlar endotel hücre aktivasyonunu tetikleyen önemli anjiyojenik büyüme faktörleri salgılar. Kombinasyon halinde, yapışık perisitler ve endotel hücreleri, fibrin jelinde endotel hücresinin filizlenmesine yardımcı olan sinyal molekülleri salgılar.
Endotel filizleri, anjiyogenezin erken aşamasını gösteren perisit sarılı uzun hücre çıkıntıları olarak görünür.
Tüm boncukların endotel hücreleri tarafından yeterince kaplandığını doğrulamak için mikro taşıyıcı kaplı boncukların tabaklarını mikroskop altında 20 kat büyütmede inceleyin.
Plakaları bir laminer akış başlığına aktarın ve hücreleri plaka tabanlarından ayırmak için kaplanmış boncuk çözeltilerini kuvvetlice aspire etmek ve dağıtmak için bir P1000 pipeti kullanın ve süpernatanları ayrı tüplere aktarın.
Boncukların üç dakika boyunca tüplerin dibine yerleşmesine izin verin. Ardından, boncuk kümelerini bozmadan mümkün olduğunca çok süpernatantı çıkarmak için P1000 pipetini kullanın. Boncukları tüp başına bir mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve boncukların 30 ila 60 saniye oturmasına izin verin. Süpernatanı tekrar aspire etmek için P1000 pipetini kullanın ve serbest yüzen endotel hücrelerini boncuk süspansiyonundan az önce gösterildiği gibi iki kez daha taze tam besiyeri ile yıkayın.
Üçüncü yıkamadan sonra, boncukları 2,5 mililitre fibrinojen çözeltisi içinde tekrar süspanse edin. 24 oyuklu bir cam alt plakaya oyuk başına 13 mikrolitre trombin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 0,5 mililitre boncuk / fibrinojen çözeltisi ekleyin, boncukları doğrudan trombine dikkatlice pipetlemeye dikkat edin ve çözeltileri iyice karıştırmak için iki ila üç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
Tüm kuyucuklar tohumlandığında, trombin-fibrinojen çözeltisinin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca laminer akış başlığında önceden pıhtılaşmasına izin verin. Kuluçka işleminin sonunda, plakayı 1,5 ila 2 saat daha dikkatlice 37 derecelik bir inkübatöre aktarın.
Jel tamamen katılaştığında, normal insan akciğer fibroblastlarını tam ortamda mililitre konsantrasyonda 2 x 104 hücrede yeniden süspanse edin ve her oyuğa bir mililitre fibroblast ekleyin. Ardından, plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.