Larva Temas Testi: Test Larvisidal Bileşiği ile Doğrudan Teması Takiben Sivrisinek Larva Ölümünü Değerlendirme Prosedürü

Bir test larva öldürücü bileşiğin potansiyelini değerlendirmek için, larva temas testi kullanan bir dopamin reseptör antagonisti, sulu ortamda istenen gelişimsel veya instar aşamasında canlı sivrisinek larvaları ile başlar. Eşit sayıda larvayı çok kuyulu bir plakanın kuyucuklarına aktarın.

Larvaları olumsuz yönde etkileyebilecek kirletici maddelerden kaynaklanan herhangi bir girişimi önlemek için kuyulardaki ortamı deiyonize su ile değiştirin. İlgili kuyucuklara test bileşiğinin artan konsantrasyonlarını ekleyin.

Larvalar ve test bileşiği arasındaki teması kolaylaştırmak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı uygun koşullar altında inkübe edin.

Larvalarla temas ettiğinde, test bileşiği vücut duvarına veya en dış katmana girer ve merkezi sinir sistemini içeren gangliyonlara - sinir hücreleri kümesine - bağlı olan trakeal sistemin açıklıkları olan spiracles'e ulaşır.

Sinir hücreleri üzerinde, test bileşiği, kritik hücresel süreçlerde yer alan dopamin reseptörlerinin ikincil bağlanma bölgelerine bağlanır. Bu bağlanma, dopamin reseptörüne bağlı nörotransmitter dopamin ile bile, reseptör aktivasyonunu ve aşağı akış sinyalleşmesini önleyerek larva gelişimini bozar ve sonuçta ölüme neden olur.

Değişen bileşik konsantrasyonlarında test bileşiği maruziyetini takiben belirli bir zaman noktasında her bir kuyucukta hareket etmeyen, yanıt vermeyen larvaların sayısını kaydedin.

Artan konsantrasyon ile artan larva ölüm oranı, test bileşiğinin larva öldürücü potansiyelini gösterir.

Başlamak için, 24 oyuklu şeffaf bir doku kültürü plakasının kuyucuklarını etiketleyin. Test bileşenini tartmak için bir analitik terazi kullanın. Daha sonra, bileşiği 1.5 mililitrelik bir tüpte steril, çift damıtılmış su içinde çözün ve 80 milimolar bir stok çözeltisi elde edin. Daha sonra, istenen konsantrasyonlarda çalışma stok çözeltilerini hazırlamak için stok çözeltisini çift damıtılmış su kullanarak seri olarak seyreltin.

Larvalar kuyulara eklendiğinde, fazla suyun uzaklaştırılması sırasında ve test kimyası eklendiğinde, larvaların fiziksel olarak zarar görmesini önlemek için dikkatli olunması gerektiğini unutmayın. Yaralanma mortaliteyi artırabilir ve bu nedenle yanlış pozitif sonuçlar üretebilir veya testi geçersiz kılabilir.

Plakanın her bir oyuğuna beş adet üçüncü instar larvası aktarmak için geniş delikli bir plastik transfer pipeti kullanın. Ardından, suyu nazikçe çıkarmak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın ve istenen hacimde çift damıtılmış su ile değiştirin.

Suyu çıkarırken larvalara dokunmamaya özen gösterin. Larvaların kurumamasını sağlamak için hızlı bir şekilde çalışın ve plastik kuyunun karşı tarafına pipetleyerek test kimyasını nazikçe ekleyin.

Her bir oyuka uygun hacimde test çözeltisi ekleyin ve homojen bir karışım sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı, %75 ila %85 bağıl nem ile 25 santigrat derecede 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsünü koruyarak bir büyüme odasına yerleştirin.

Larva hareketini kontrol etmek için plakaya hafifçe vurun. Herhangi bir hareket gözlenmezse, larvaya steril bir kürdan ile hafifçe dokunun. Herhangi bir yanıt fark edilmezse larvaları ölü olarak puanlayın ve metin protokolünde açıklanan zaman noktalarında her bir kuyucuktaki toplam ölü larva sayısını kaydetmek için bir puan sayfası kullanın.