Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Hücredeki yanlış katlanmış proteinlerin uzaklaştırılması, büyük ölçüde hücresel ubikitin-proteazom sistemi tarafından düzenlenir, burada protein ilk olarak küçük bir düzenleyici protein olan ubikitin tarafından tanınır ve etiketlenir ve hidroliz ve klerens için bir multiprotein kompleksi olan proteazoma gönderilir.

Nörodejeneratif hastalıklarda sık görülen bozulmuş ubikitin-proteozom sistem aktivitesi, yanlış katlanmış proteinlerin hücreler içinde birikmesine ve sitotoksik etkilere sahip çözünmeyen protein agregatları oluşturmasına neden olabilir.

Protein agregasyonunu in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için, uygun ortamda, maruz kalan hidrofobik kalıntılarla yanlış katlanmış bir konformasyonu benimseyen floresan etiketli bir mutant proteini ifade eden, dönüştürülmüş memeli hücrelerinin bir süspansiyonunu elde edin.

Görüntüleme sırasında arka plan floresansını en aza indirmek için bir proteazom inhibitörünün artan konsantrasyonlarını siyah çok kuyulu bir plakanın kuyularına pipetleyin. Memeli hücre süspansiyonunu kuyucuklara tohumlayın. Hücrelerin plaka tabanına yapışmasını ve çoğalmasını sağlamak için inkübe edin.

İçeri girdikten sonra, proteazom inhibitörü proteazomun proteolitik bölgelerine bağlanır ve aktivitesini bloke eder, bu da eksprese edilen mutant proteinlerin birikmesine neden olur, bu proteinler daha sonra açıkta kalan hidrofobik kalıntıları yoluyla etkileşime girer ve sitoplazmik agregatlar oluşturur ve sonunda hücre ölümüne yol açar.

Hücre çekirdeğini boyamak için floresan DNA bağlayıcı bir boya ekleyin. Plakayı görüntüleyin. Floresan mutant protein agregatları, boyanmamış sitoplazma içinde dağılmış görünür.

Daha yüksek proteazom inhibitör konsantrasyonları içeren kuyucuklar, daha düşük proteazom inhibitör konsantrasyonlarına sahip kuyucuklara göre daha yüksek protein agregat sayılarının hücre sayısına oranı sergiler.

Bileşik transferi için, 384 oyuklu bir depolama polipropilen plakası üzerinde, standart 1 ila 3 seyreltme serisi ile bileşiklerin seri seyreltmelerini ekleyin. Daha sonra, 384 kılcal kafa ile donatılmış bir sıvı işleyici kullanarak, boş düz tabanlı siyah 384 kuyulu tahlil plakalarına 0.25 mikrolitre proteazom inhibitörü dağıtın. Daha sonra bu plakalara 1,5 x 10⁴ hücre tohumlayın. 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Proteazom inhibitörleri ile muamele edilen hücre hattını görüntülemeden önce, boyama solüsyonu ile 10 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Boyamadan sonra, "Mikroskop" sekmesini seçerek otomatik mikroskop çalıştırma yazılımını başlatın. Önce "Konfigürasyon" sekmesini seçin ve ardından 20X objektifi ve doğru plaka tipini seçin.

Farklı plaka tipleriyle doğru odaklamaya izin vermek için, "Yaka"nın objektif üzerinde doğru değere ayarlandığından emin olun.

Ardından, 'Pozlama 1'i seçin, odak yüksekliğini '0 mikrometre' olarak ayarlayın, ardından "Odak"ı seçin. Odaklandıktan sonra Kamera 1'i pozlayın.

Pozlama düzlemini optimize etmek için odak yüksekliğini ayarlayın ve "Yüksekliği Al"a tıklayın. Lazer gücündeki pozlama sürelerini yaklaşık 3.000 maksimum piksel yoğunluğu için değiştirin ve pozlama parametrelerini kaydedin.

"Deney Tanımı" sekmesini seçin. Bir düzen ve alt düzen oluşturun. Ardından, ilgili düzeni, pozlamayı, referans görüntüsünü, eğrilik dosyasını ve alt düzeni sürükleyip bırakın. Ardından, denemeyi kaydedin.

Son olarak, "Otomatik Deneme" sekmesini seçin ve görüntüleri alın. 2 kanallı görüntüler için önce çekirdekler, sitozol ve agregalar gibi birincil nesneleri segmentlere ayırmak için yazılım algoritmasını seçin.