Endotoksin Aktivite Testi: Kan Örneğindeki Endotoksin Aktivitesini Araştırmak İçin Kemilüminesans Bazlı Bir Biyo-Test

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 4:25 dk • July 8th, 2025

Gram negatif bakterilerde, lipopolisakkarit endotoksinler bakteri dış zarının hayati bileşenleridir.

Yapısal olarak, bir endotoksin, endotoksin aktivitesi için çok önemli olan immünostimülatör bir glikolipid olan lipid A'ya merkezi bir çekirdek aracılığıyla bağlanan en dıştaki polisakkarit zinciri olan O-antijenden oluşur.

Endotoksin aktivitesini araştırmak için, anti-lipid A antikorları, zimozan - eksojen bir nötrofil aktivatörü ve luminol - bir kemilüminesan ajan içeren uygun bir tampon içeren bir test tüpü alın.

Nötrofiller de dahil olmak üzere endotoksinler ve kan hücreleri içeren enfekte bir kan örneğinin optimum hacmini askıya alın. Tüpü fizyolojik koşullar altında inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, anti-lipid A antikoru, endotoksinin lipid-A bileşenini tanır ve antijen bağlama alanları yoluyla ona bağlanır, bu da bir antikor-endotoksin kompleksinin oluşumuna neden olur.

Endotoksine bağlı antikorun FC alanı, nötrofillerin tamamlayıcı reseptörüne bağlanır ve bağlı endotoksinleri nötrofillere sunar. Bu bağlanma, nötrofiller için bir hazırlama uyarıcısı görevi görür ve aktivasyonlarını tetikler.

Aktive edilmiş nötrofiller zimozanı yutar ve bir bağışıklık tepkisi başlatır, bu da nötrofillerden reaktif oksijen türlerinin (ROS) hızlı bir şekilde salınmasına neden olur. Bu ROS, luminol oksidasyonunu kolaylaştırarak kemilüminesans yoluyla ışık emisyonuna neden olur.

Kemilüminesans sinyal yoğunluğu, kan örneğindeki endotoksin aktivitesine karşılık gelir.

İlk olarak, kullanılacak EA tüplerini tüp raflarına yerleştirin ve kapakları çıkarın. 1 mililitre EA reaktifini şişeden 1, 2 ve 3 numaralı tüplere aktarmak için bir kombi pipet kullanın. Hastanın kan örneğini karıştırmak için kan alma tüpünü 20 kez hafifçe ters çevirin. Daha sonra 0,5 mililitre hasta kanını 4 numaralı ve 5 numaralı tüplere pipetleyin. 4 numaralı tüpü 10 saniye boyunca girdaplayın.

Tüp raflarını tüm EA test tüpleriyle birlikte inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin, kapağı kapatın ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, inkübatör kapağını açın ve tüp raflarını çalkalayıcıdan çıkarın.

5 numaralı girdap tüpü. Steril bir uç kullanarak, 40 mikrolitre kanı iki kez 1 ve 2 numaralı tüplere pipetleyin.

4 numaralı girdap tüpü. Aynı pipet ucunu kullanarak, 4 numaralı tüpten 40 mikrolitre kanı iki parça halinde 3 numaralı tüpe aktarın.

Son altı test tüpünü tek tek girdaplayın. Tüp raflarını inkübe çalkalayıcıya geri yerleştirin ve kapağı kapatın. Çalkalayıcıyı 100 RPM'ye ayarlayın ve hareketi 14 dakika boyunca başlatın.

EA etiketli çip kartını kemilümometreye takın ve 'Başlat'a basın. 14 dakikalık inkübasyondan sonra, kemilüminometrede görüntülenen talimatları izleyin. Kemilüminometrenin numune tutucusuna yerleştirmeden önce her bir tüpü 10 saniye boyunca hafifçe girdaplayın.

Numune çekmecesini açın ve 1 numaralı tüpü numune tutucuya yerleştirin. Ardından, numune çekmecesini kapatın ve Bağıl Işık Birimi okumasını bekleyin. Bu okuma işlemini tüp 2 ve 3 için ve metin protokolünde belirtildiği gibi tüm kopyalar için tekrarlayın.

Tüm tüpler işlendikten sonra, EA sonuçları otomatik olarak hesaplanacak ve yazdırılacaktır.

Test edilmesi gereken her kan örneği için tüm tahlil işlemini tekrarlayın. EA tahlil kitini ve bileşenlerini orijinal kapalı ambalajında, 2 ila 25 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta saklayın.

12:57

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:48

Sağlıklı İnsanlarda İntravenöz Endotoksin Mücadelesi: Deneysel Bir Platform Araştırma ve Sistemik Enflamasyon Değiştirmeye Yönelik

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:56

Sıçanlarda Tekrarlanabilir Yoğun Bakım Ünitesi Odaklı Bir Endotoksin Modeli

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:08

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

İlgili videolar

0 Görüntüler

14:29

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:38

Türbidimetrik Limulus Amiposit Lizat Testi: Nano Formüllü İlaçlarda Endotoksin Kontaminasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:57

Jel-Pıhtı Limulus Amip Lizat Testi: Nanopartikül Formülasyonlarında Bakteriyel Endotoksin Tayini İçin Bir Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:08

Makrofajlarda TLR'ye Bağımlı NF-кB/AP-1 Transkripsiyon Faktörü Sinyalizasyonu için Bir Test

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:16

Endotoksin ve DNA İçeriği için Hava örneklenmiş Filtresi Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:04

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026