JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:38 dk • July 8th, 2025
Dış zarda bulunan gram negatif bir bakteri toksini olan endotoksin, lipid A ve O-antijen dahil olmak üzere esas olarak lipitler ve polisakkaritlerden oluşan bir lipopolisakkarit, LPS'dir. Enfeksiyon sırasında serbest bırakıldığında, bağışıklık sistemi tarafından tanınır ve sitokin bazlı inflamatuar yanıtları tetikler.
Limulus amoebosit lizatı, LAL kullanılarak bir lipozomal ilaç nano formülasyonunda endotoksin kontaminasyonunu tahmin etmek için, tahlil, biri ilacı içeren ve diğeri ilacı içeren reaksiyon tüpleri hazırlayın, bilinen bir endotoksin konsantrasyonu ile çivilenmiş olarak.
At nalı yengeci, Limulus polyphemus, kan hücreleri veya amimositlerden elde edilen protein lizat içeren LAL reaktifi ekleyin. Lizat, aktif olmayan serin proteazları - faktör B, faktör C, pıhtılaşma enzimi - ve bir jel pıhtılaşma proteini, pıhtılaştırıcı içerir.
Tüpleri vorteksleyin ve çözeltilerin bulanıklığını ölçmek için bir bulanıklık ölçere yükleyin.
Lipozomal ilaçlara bağlı kontamine LPS'nin varlığında, LPS'ye duyarlı faktör C otokatalitik olarak aktive edilir, bu daha sonra pıhtılaşma enzimini pıhtılaşma enzimine dönüştüren faktör B'yi parçalar ve aktive eder. Bu aktive edilmiş enzim, koagülojen peptit bağlarını parçalayarak koagülin monomerleri oluşturur.
Sonunda, monomerler, birinin kafasındaki açıkta kalan hidrofobik bölgeler ile diğerinin hidrofobik kuyruğu arasındaki etkileşimler yoluyla polimerize olur ve bu da çözünmeyen bulanık pıhtılaşma jelinin toplanmasına ve oluşumuna yol açar. Ölçülen bulanıklık, nano formülasyondaki endotoksin konsantrasyonunun belirlenmesine yardımcı olur.
Kabul edilebilir aralıktaki çivili ve test numunelerindeki endotoksin konsantrasyonlarından hesaplanan spike geri kazanımı, nano formülasyondan önemli bir girişim olmadığını gösterir ve nano formüle edilmiş ilaçta endotoksinlerin varlığını doğrular.
Kalibrasyon standardı hazırlığı için, mililitre başına bir endotoksin birimi konsantrasyonuna sahip bir kalibrasyon standardının hazırlanmasını sağlamak için gerektiği kadar ara seyreltme hazırlamak için 900 mikrolitre Limulus Amebosit Lizat veya LAL dereceli su ve 100 mikrolitre kontrol standardı endotoksin kullanın.
Daha sonra, 900 mikrolitre LAL dereceli su ve mililitre başına bir endotoksin birimi kalibrasyon standardının 100 mikrolitresini kullanarak, mililitre başına 0.1 endotoksin birimi konsantrasyonunda ikinci bir kalibrasyon standardı hazırlayın.
Ardından, mililitre başına 0.001 ila 1 endotoksin birimi arasında değişen toplam dört kalibrasyon standardı elde etmek için iki düşük kalibrasyon standardı hazırlamak için seri 10 kat seyreltmeyi tekrarlayın.
Mililitre başına 0.05 endotoksin birimi kalite kontrolü hazırlamak için, kontrol standardı endotoksin çözeltisinin mililitresi başına bir endotoksin biriminin 50 mikrolitresini 950 mikrolitre LAL dereceli su ile birleştirin.
Ardından, yazılımda 'Cihaz ayarları'nı seçin ve şablonu oluşturun. 'Veri topla'yı seçin ve 'Genel' sekmesine test kimliğini ve veri grubunu girin. 'Donanım' sekmesi altında, cihaz tipini ve LAL yöntemini seçin ve ekranda bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgilerinin göründüğünü doğrulayın.
Cihaz seçimini ve cihazla iletişimi onaylamak için iki kez 'Tamam'a tıklayın ve numune kimliklerini, numunelerin test edileceği sırayla girin. Ardından, negatif kontrolü, standart eğriyi ve test örneklerini girmek için varsayılan düğmeleri kullanın.
Uygun hacimde negatif kontrol kalibrasyon standartlarını ve kalite kontrolünü çift önceden etiketlenmiş cam tüplere ekleyin ve uygun hacimde LAL'i ilk test şişesine ekleyin. Şişeyi kısa bir süre vorteksleyin ve şişeyi alet karuselindeki uygun test yuvalarına yerleştirin.
Numuneleri yüklemeden önce, gösterildiği gibi maksimum geçerli seyreltme içinde test nanomalzemesinin birkaç seyreltmesini gerçekleştirin.