JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:27 dk. • July 8th, 2025
Biyokütle, esas olarak karmaşık polisakkaritlerden oluşan bitki kaynaklı bir organik maddedir. Karbonhidrat parçalayıcı enzimler, daha küçük oligosakkaritler üretmek için bu polisakkaritler üzerinde hareket eder.
Bir enzimin bozunma aktivitesini değerlendirmek için, gözenekli bir reaksiyon plakasının kuyucuklarında bulunan farklı çözünmeyen kromojenik biyokütle - ICB substratları alarak başlayın. Bu substratlar, bitki türevli malzemelerin belirli bir renk klorotriazin boyası ile boyanmasından elde edilir. Elde edilen biyokütle, enzim aktivitesi için bir substrat görevi gören boya etiketli kompleks polisakkaritlere sahiptir.
Şimdi, karbonhidrat hidrolize edici enzim içeren bir tampon çözelti ekleyin. Tampon, optimum enzim aktivitesi için pH'ı korur. Reaksiyon plakasını bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve inkübe edin. Sürekli çalkalama, enzim moleküllerinin ICB substratındaki hedef polisakkarite ulaşmasını sağlar.
İnkübasyon sırasında, hidrolize edici enzim, uzun zincirli polisakkaritler içindeki kovalent glikozidik bağları parçalar. Reaksiyon, çözelti içinde kalan boya moleküllerine bağlı çözünür oligosakkaritler üretir.
Bozunma tamamlandıktan sonra, reaksiyon plakasını bir ürün plakasının üzerine yerleştirin ve düzeneği santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, reaksiyon ürünleri içeren renkli çözelti, plakanın altındaki filtreden geçer ve ürün plakasında toplanır. Bir plaka okuyucu kullanarak, süpernatantın emilimini kaydedin.
Daha yüksek bir absorbans değeri, çok sayıda boyaya bağlı oligosakkaritin üretilmesini gösterir - enzimin ICB substratını parçalamadaki etkinliğini gösterir.
Kromojenik testi kırmızı Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle veya ICB-buğday samanı ile gerçekleştirmek için, tahlil plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre aktivasyon çözeltisi ekleyerek başlayın. Daha sonra, plakayı 10 dakika boyunca çalkalamadan oda sıcaklığında inkübe edin.
Kuyuları üç kez yıkamak için 100 mikrolitre steril su kullanarak stabilizatörü çıkarın. Daha sonra, 150 mikrolitre 100 milimolar sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve mililitre farklı endo-ksilanaz çözeltisi başına 5 mikrolitre 10 birim ekleyin.
Çalkalama sırasında alt tabaka plakasından herhangi bir olası sızıntıyı toplamak için ürün plakasını alt tabaka plakasının altına yerleştirin ve reaksiyonu oda sıcaklığında ve 100 RPM'de 2 saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, tahlil kiti plakasını, ürün plakası altında olacak şekilde santrifüje yerleştirin ve reaksiyon ürününü ürün plakasının kuyucuklarına aktarmak için 10 dakika boyunca 2.700 x g'da döndürün.
Her kuyucuğundaki sıvı hacminin yaklaşık olarak aynı olduğunu kontrol edin. Ardından, bir plaka okuyucu kullanarak, kırmızı ICB-buğday samanı için 517 nanometrede toplama plakasının emilimini okuyun.