JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:31 dk • July 8th, 2025
Mitokanlar, kanser hücrelerinde mitokondrinin işleyişini seçici olarak etkileyen ve apoptozu indükleyen bir ilaç sınıfıdır.
Mitokan sitotoksisitesini belirlemek için, yarı yapışık kanser hücreleri içeren bir hücre süspansiyonunu çok kuyucuklu bir plaka üzerine tohumlayın. Plakaya istenen mitocan çözeltisi uygulayın ve inkübe edin.
Mitocan, mitokondriyal aktivitesini bozmak için kanser hücresine girer ve sonunda mitokana duyarlı kanser hücrelerinde hücre ölümüne yol açar. Hücrelere, Hoechst boyası ve propidyum iyodür karışımı içeren bir boyama çözeltisi uygulayın.
Zar geçirgen bir floresan boya olan Hoechst, tüm hücrelere nüfuz eder ve DNA'larının AT açısından zengin bölgesine bağlanarak hem canlı hem de ölü hücrelerin çekirdeklerine mavi bir floresan verir.
Buna karşılık, zar geçirimsiz bir floresan boya olan propidyum iyodür, ölü hücrelere yalnızca zarlarının hasarlı kısımlarından girer. Boya, DNA bazları arasında interkalasyon yaparak ölü hücrelere ek bir kırmızı floresan verir. Bu hücrelerin çekirdeğinde her iki boyanın da bulunması, ölü hücrelerin mor görünmesine neden olur.
Görüntüleme sırasında daha fazla doğruluk için hücreleri yerleştirmek için plakayı düşük bir hızda santrifüjleyin. Floresan mikroskobu altında görüntüleyin ve iki farklı hücre popülasyonunu gözlemleyin. Her iki hücre türünün sayısını sayın.
Toplam popülasyona kıyasla ölü popülasyonu temsil eden mor hücrelerin yüzdesi, test mitokanının sitotoksik potansiyelini gösterir.
İstenilen konsantrasyonda ilgilenilen bileşiklerin çözeltilerini hazırlayarak başlayın. Bileşikleri her zaman iyice girdaplayarak karıştırdığınızdan emin olun.
Tek bir bileşiğin sitotoksisitesini ölçmek için, 2X nihai konsantrasyonda bileşikler hazırlayın. Bileşik kombinasyonlarının sitotoksisitesini ölçüyorsanız, bunları 4X nihai konsantrasyonda hazırlayın.
Aynı miktarda çözücüyü uygun ortamla karıştırarak yalnızca çözücü kontrolleri hazırlayın. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve tripan mavisi boyama için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu alın. Alikot'a 10 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ekleyin ve canlı ve cansız hücreleri saymak için bir hemositometre veya hücre sayacı kullanın.
15 mililitrelik tüpteki pelet hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da, daha sonra süpernatanı aspire edin veya boşaltın. Hücre peletini, mililitre başına 3x105 hücre hücre yoğunluğunda tahlile uygun ortamda yeniden süspanse edin. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlamak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Tek bileşik tahliller için, her bir oyuğa 50 mikrolitre 2X bileşik çözelti ekleyin. Solvent kontrol kuyuları için, 2X konsantrasyonda solvent içeren 50 mikrolitre test ortamı ekleyin. Kombinasyon tahlilleri için, her bir oyuğa 4X bileşiklerinin her birinden 25 mikrolitre ekleyin. Tek bileşik kontrol kuyuları için, her biri 25X bileşik çözeltisi ve test ortamının her birine 4 mikrolitre ekleyin. DMSO'nun nihai konsantrasyonunun% 0,5'i geçmediğinden emin olun.
Tekrarlanabilirliği sağlamak için, ilaçları pipet ucu kuyuların kenarına değecek şekilde ekleyin, ilaçları farklı yerlere eklemeye dikkat edin. Bu adım çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, tercihen plaka başına 30 dakikadan fazla sürmemelidir.
Kuyucukların içeriğini karıştırmak için plakaya hafifçe vurun ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Hücreleri Hoechst 33342 ve propidium iyodür ile boyamaya hazır olduğunuzda, taze 10X boyama çözeltisi hazırlayın ve her oyuğa 10 mikrolitre ekleyin. Plakaya hafifçe vurun ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.
Tüm hücreleri plakanın dibine getirmek için plakayı 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Ardından, görüntülemeyi engelleyebilecek kalıntıları temizlemek için plakanın altını nemli bir laboratuvar mendiliyle dikkatlice silin. Santrifüjlemeden sonra plakayı 15 dakika içinde görüntüleyin.