Ek V Bağlanma Testi: Fosfatidilserin Etiketleme Yoluyla Apoptotik Eritrositleri Tanımlamak için Floresan Bazlı Bir Teknik

Bazı patolojik durumlar sırasında, eritrositler veya kırmızı kan hücreleri, membran fosfolipidinin - fosfatidilserin - iç kısımdan dış zar broşürüne translokasyonu ile birlikte hücre büzülmesine uğrar, bu da programlanmış hücre ölümüne, eriptoza yol açar ve makrofaj aracılı hücre fagositozunu tetikler.

Annexin V bağlanma testi ile izole edilmiş insan eritrosit popülasyonunda iyonoforun neden olduğu eritozu ölçmek için, glikoz içermeyen bir tampon içinde süspanse edilmiş eritrositlerle başlayın.

Glikoz tükenmesi, daha sonra kalsiyum kanallarını aktive eden ve kalsiyum iyonu akışına neden olan sitozolik protein kinaz C'yi aktive ederek hücresel strese neden olur. Ayrıca, potasyum kanalları aktive edilerek potasyum akışına ve hücre büzülmesine neden olur.

Daha sonra, hücre dışı kalsiyum iyonları ile stabil bir kompleks oluşturan kalsiyum iyonofor ekleyin. Kompleks, kalsiyum iyonlarının hücre zarı boyunca sitozolik girişini kolaylaştırarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu daha da artırır. Bu da, fosfatidilserinin iç hücre zarı broşüründen dış hücre zarı broşürüne translokasyonuna yardımcı olan, zar asimetrisini azaltan ve eriptozu indükleyen çift yönlü bir fosfolipid taşıyıcı olan scramblase'ı aktive eder.

İyonoforla tedavi edilmiş eritrositleri santrifüjleyin. Hücreleri kalsiyum içeren bir bağlanma tamponunda yeniden süspanse edin. Floresan boya konjuge Annexin V çözeltisi ekleyin.

Yüksek fosfatidilserin afinitesine sahip kalsiyuma bağımlı fosfolipid bağlayıcı protein olan Annexin V, dış hücre zarı broşürü üzerindeki açıkta kalan fosfatidilserin kalıntılarına bağlanır.

Floresanla aktive edilen hücre sıralamasını kullanarak, eritrosit popülasyonunu Annexin V floresan yoğunluğuna göre ayırın. Eriptotik eritrositler, sağlıklı eritrositlerden daha yüksek Annexin V floresan yoğunluğu sergiler.

1X bağlama tamponu elde etmek için 5X Annexin V bağlama tamponunun 2 mililitresini 8 mililitre PBS ile seyreltin. İyonomisin ile muamele edilmiş ve işlenmemiş hücre peletlerini 1X bağlayıcı tamponun 1 mililitresinde yeniden süspanse edin.

Bağlama tamponunda 235 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne 15 mikrolitre Annexin V-Alexa Fluor 488 konjugatı ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında karanlık bir yerde 20 dakika inkübe edin.

Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Hücre peletini 1.5 mililitre bağlayıcı tampon içinde süspanse ederek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyerek hücreleri 1X bağlama tamponu ile iki kez yıkayın.

Süpernatanı çıkarın ve akış sitometrisi ölçümleri için hücre peletlerini 250 mikrolitre 1X bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin. Şimdi, 200 mikrolitre Annexin V ile boyanmış eritrositleri akış sitometrisi ile uyumlu 1 mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktarın.

Akış sitometrisi yazılımına giriş yapın ve 'Yeni Deney' düğmesine tıklayın. 'Yeni Tüp' düğmesine tıklayın, 'Global Sayfa'yı seçin ve 488 nanometre uyarma dalga boyu ve 530 nanometre emisyon dalga boyu ile floresan yoğunluğunu ölçmek için 'Analiz Uygula'yı seçin.

Floresanla aktive edilen hücre sıralama analizi için toplanacak hücre sayısını 20.000 olarak ayarlayın. İstediğiniz tüpü seçin ve 'Yükle' düğmesine tıklayın. İleri saçılma ve yan saçılma ölçümleri için 'Kaydet' düğmesine tıklayın. Tüm numuneler için tekrarlayın.

'Numune' düğmesine sağ tıklayın ve sonuç dosyasını oluşturmak için 'Toplu Analizi Uygula'ya tıklayın. 'Örnek' düğmesine sağ tıklayın ve 'FSC Dosyaları Oluştur'a tıklayın.