JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:04 dk. • July 8th, 2025
Dokularda, hücre dışı glikoz, spesifik glikoz taşıyıcıları yoluyla kolaylaştırılmış difüzyon yoluyla hücrelere girer.
Glikoz, hücresel metabolik süreçler için adenozin trifosfat veya ATP formunda enerji üreten metabolik bir yol olan glikoliz yoluyla hücre sitoplazmasında piruvata parçalanır.
Glikoz alımını ex vivo ölçmek için, taze hasat edilmiş küçük boyutlu fare karaciğer dokusu ile başlayın. Fizyolojik koşulları korumak için uygun tampon ekleyin.
Daha sonra, dokuyu glikoz içermeyen ortam içeren çok kuyulu bir plakaya aktarın. Bunu, floresan etiketli bir glikoz analoğu olan deoksiglukoz ile desteklenmiş glikoz içermeyen ortamda inkübasyon ile takip edin. Dokunun küçük boyutu deoksiglukozun girmesine izin verir.
Deoksiglukoz, glikoz yokluğunda hücrelere glikoz taşıyıcıları yoluyla girer. Hücreler içinde, deoksiglukoz fosforilasyona uğrar, ancak daha fazla metabolize edilmez ve bu da birikmesine yol açar.
Kullanılmayan floresan etiketli deoksiglukoz içeren ortamları istenen zaman noktalarında toplayın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, deoksiglukozun hücre içi doku alımı ile ilişkilendirilebilen hücre dışı deoksiglukozun floresansını ölçün.
Hasat edilen dokuları veya organları bir dakika boyunca PBS içeren 6 oyuklu bir plakada inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun. Bir dakika sonra, PBS'yi emmek için her dokuyu steril bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
Dokuları veya organları 4.000 mikrolitre glikoz içermeyen DMEM içeren 6 oyuklu ayrı bir plakaya aktarın ve iki dakika inkübe edin. İki dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 milimolar FD-glikoz çalışma çözeltisi içeren 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Dokuları içeren 6 oyuklu plakaları FD-glikoz çalışma solüsyonunda 37 santigrat derecede inkübe edin.
0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her kuyucuktan 100 mikrolitre FD-glikoz çalışma çözeltisi toplayın ve toplanan 100 mikrolitre FD-glikoz çalışma çözeltisini hücre dışı FD-glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 96 oyuklu plakalara aktarın. Toplamadan önce ve sonra çalkalayın.
Bir mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla 485 ve 535 nanometre uyarma ve emisyon dalga boylarında floresansı ölçün.