$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bağırsak organoidleri, ölü hücreler ve döküntüler içeren merkezi bir lümene sahip bağırsak benzeri kript-villus organizasyonunu özetler. Lümen, villus benzeri hücreler ve kök hücreleri barındıran tomurcuklanan, kript benzeri çıkıntılarla kaplıdır.
Farklı organoid hücreler, birikimi oksidatif strese yol açan metabolik aktivitelerin yan ürünleri olan ROS - değişen seviyelerde reaktif oksijen türleri üretir.
Çeşitli hücrelerde oksidatif stresi görselleştirmek için, bir bodrum matrisinde kültürlenmiş 3D organoidler içeren çok kuyulu bir plaka alarak başlayın. Organoid kök hücreler, görüntüleme sırasında onları ayırt etmeye yardımcı olan yeşil bir floresan proteini veya GFP etiketli proteini ifade eder.
Kuyuları bir ROS indükleyicisi olan tert-bütil hidroperoksit ile destekleyin ve inkübe edin. İndükleyici, zara bağlı NADPH oksidazı aktive eder ve hücrelerin içinde ROS üretimini uyarır. Metabolik olarak aktif olan kök hücreler, farklılaşmış hücrelerden daha fazla ROS üretir.
ROS'a duyarlı florojenik problar ekleyin. Bu lipofilik problar hızla hücrelere girer ve kırmızı floresan üretmek için ROS ile reaksiyona girer. Organoidleri, canlı hücre çekirdeklerini seçici olarak boyayan Hoechst boyası ile muamele edin. Konfokal mikroskop kullanarak organoidleri görüntüleyin.
Lekeli çekirdeğe sahip periferdeki organoid hücreler, GFP eksprese eden kök hücrelerde yüksek ve farklılaşmış hücrelerde düşük olan değişen derecelerde kırmızı floresan gösterir. Doğası gereği yüksek ROS seviyelerine sahip ölü hücreler, lümende kırmızı floresan sergiler.
Kırmızı floresan yoğunluğu, farklı hücre tiplerinde değişken oksidatif stres seviyeleri ile ilişkilidir.
Oksidatif stresi konfokal mikroskopi ile görselleştirmek için, organoidlerle kaplanmış mikro slayt sekiz oyuklu odanın karşılık gelen kuyucuklarına 1 mikrolitre N-asetilsistein stok çözeltisi ekleyin.
1 saatlik bir inkübasyondan sonra, ilgili kuyucuklara 1 mikrolitre Tert-bütil hidroperoksit stok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Daha sonra, kuyucuk başına florojenik probun 1.25 milimolar seyreltmesinden 1 mikrolitre ekleyin, ardından mililitre Hoechst çözeltisi başına 1 mikrolitre 1.25 miligram ekleyin.
30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, BMM'yi rahatsız etmeden ortamı çıkarın ve fenol kırmızısı içermeyen 250 mikrolitre ılık DMEM ekleyin.
Organoidleri, florojenik probu algılayan bir termik oda ve gaz kaynağı ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleyin.
Pozitif kontrolü kullanarak, ROS sinyali için lazer yoğunluğunu ve zamana maruz kalmayı ayarlayın ve bu sinyalin negatif kontrolde daha düşük olduğunu kontrol edin. Ardından, bir mercek kullanarak, GFP'yi ifade eden organoidleri tanımlamak için slaydı tarayın ve lazer yoğunluğunu ayarlayın.
25 mikrometrelik bir z-yığını ayarlayın ve organoidlerin bir hücre katmanını gösteren bir bölümünü elde etmek için tüm organoidin dikişli bir görüntüsünü elde etmek için konumları tanımlayın.