JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:29 dk • July 8th, 2025
Bağırsak hücreleri reaktif oksijen türleri üretir - ROS. Orta ROS seviyeleri hücresel homeostazı korurken, yüksek ROS seviyeleri hücre ölümüne neden olabilir.
ROS seviyelerini in vitro olarak ölçmek için, fare bağırsağı 3D organoidleri kültürü ile başlayın. Bu organoidler, yeşil floresan ifade eden kök hücreleri barındıran kript benzeri çıkıntılara sahip bağırsak epitel mimarisi sergiler. Ayrıca, ölü hücreler ve döküntüler içeren merkezi lümeni çevreleyen periferde villus benzeri farklılaşmış hücreler içerirler. Tüm bu hücreler farklı seviyelerde ROS üretir.
Şimdi, belirlenen kuyucuklardaki organoidleri ROS modülatörleri ile tedavi edin. Doğalarına bağlı olarak, modülatörler ROS indükleyicileri veya inhibitörleri olarak işlev görebilir. İstenilen süre boyunca inkübe ettikten sonra, harcanan ortamı çıkarın.
Kültüre proteolitik bir enzim ekleyin, organoidlerin 3D mimarisini bozun ve farklı hücreleri süspansiyon halinde serbest bırakın. Ardından, ROS'a duyarlı bir florojenik prob ekleyin ve inkübe edin.
Hücrelere girdikten sonra, problar ROS ile reaksiyona girer ve kırmızı floresan üretmek için oksitlenir. Hücreleri, ölü hücrelerin çekirdeklerini seçici olarak boyayan ve canlı hücrelerle bir kontrast oluşturan DNA bağlayıcı bir floresan boya olan DAPI ile tedavi edin.
Bir akış sitometresi kullanarak, ROS seviyelerine karşılık gelen kırmızı bir floresan sinyali elde etmek için DAPI negatif canlı hücreleri analiz edin. Modülatörlerin doğasına bağlı olarak, indükleyiciler ROS seviyelerini arttırırken inhibitörler bunları azaltır.
Organoidleri içeren 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakanın negatif kontrol kuyularına 1 mikrolitre N-asetil sistein stok çözeltisi ekleyin.
1 saatlik bir inkübasyondan sonra, ilgili kuyucuklara 1 mikrolitre Tert-bütil hidroperoksit stok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak, takılı BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın ve 96 oyuklu başka bir yuvarlak tabanlı plakaya aktarın. Bu tabağı bir kenara koyun.
Daha sonra, 100 mikrolitre tripsin ekleyin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, BMM'yi yok etmek için beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 5 dakikalık kısa bir inkübasyondan sonra, ikinci kez yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri ayırın.
Plakayı döndürün ve plakayı ters çevirerek süpernatanı atın. Daha önce başka bir 96 oyuklu plakada toplanan besiyerini tekrar karşılık gelen oyuklara ekleyin ve hücreleri beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
Daha sonra, 1 mikrolitre florojenik prob ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, plakayı tekrar döndürün ve hücreleri 250 mikrolitre DAPI çözeltisi ile tekrar askıya alın. Numuneleri Flow sitometri tüplerine aktarın ve tüpleri buz üzerinde tutun.
Tek lekeli numuneler kullanarak her florofor için lekesiz kontrol ve lazer voltajlarında ileri ve yan saçılma voltajı ayarlarını optimize edin. Ardından, uygun bir geçit stratejisi kullanarak en az 20.000 olay toplayın.