SUMOylation Assay: İmmünoblotlama ile Substrat Proteinlerinin SUMOylation Durumunu Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

SUMOylation, küçük ubikitin benzeri değiştiricilerin, SUMO'ların substrat proteinlerine bağlanması nedeniyle meydana gelir.

SUMOylation, olgun bir SUMO peptidi bir enzim - E1 tarafından aktive edildiğinde meydana gelir. Aktivasyon üzerine, SUMO, konjuge edici enzimin - E2'nin aktif bölgesine aktarılır - SUMO'yu substrat proteininin lizin kalıntısına bağlar. Başka bir ligaz - E3 - bu etkileşimin verimliliğini arttırır.

Bir in vitro SUMOylation testi gerçekleştirmek için, substrat proteini - p53, enzimler ve SUMO peptitlerinin bir karışımını içeren bir tüp ile başlayın ve SUMOylation'ı indüklemek için inkübe edin. Tüpü sodyum dodesil sülfat - SDS içeren tampon ile destekleyin ve reaksiyonu sonlandırın. Proteinleri denatüre etmek için numuneyi ısıtın.

Protein karışımını bir SDS-PAGE jelinin kuyucuğuna yükleyin ve elektroforez gerçekleştirin. Daha yüksek moleküler ağırlıklı SUMOile proteinler, SUMOile edilmemiş varyantlarından daha yavaş hareket eder ve iki farklı bant oluşturur.

Jeli, bir elektroblotlama aparatında ıslak bir filtre kağıdı üzerinde bulunan bir lekeleme zarına aktarın. Islak bir filtre kağıdı ile örtün ve proteinleri jelden zara elektro-transfer edin.

Membranı, p53'e ba