SUMOylation Assay: İmmünoblotlama ile Substrat Proteinlerinin SUMOylation Durumunu Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

SUMOylation, küçük ubikitin benzeri değiştiricilerin, SUMO'ların substrat proteinlerine bağlanması nedeniyle meydana gelir.

SUMOylation, olgun bir SUMO peptidi bir enzim - E1 tarafından aktive edildiğinde meydana gelir. Aktivasyon üzerine, SUMO, konjuge edici enzimin - E2'nin aktif bölgesine aktarılır - SUMO'yu substrat proteininin lizin kalıntısına bağlar. Başka bir ligaz - E3 - bu etkileşimin verimliliğini arttırır.

Bir in vitro SUMOylation testi gerçekleştirmek için, substrat proteini - p53, enzimler ve SUMO peptitlerinin bir karışımını içeren bir tüp ile başlayın ve SUMOylation'ı indüklemek için inkübe edin. Tüpü sodyum dodesil sülfat - SDS içeren tampon ile destekleyin ve reaksiyonu sonlandırın. Proteinleri denatüre etmek için numuneyi ısıtın.

Protein karışımını bir SDS-PAGE jelinin kuyucuğuna yükleyin ve elektroforez gerçekleştirin. Daha yüksek moleküler ağırlıklı SUMOile proteinler, SUMOile edilmemiş varyantlarından daha yavaş hareket eder ve iki farklı bant oluşturur.

Jeli, bir elektroblotlama aparatında ıslak bir filtre kağıdı üzerinde bulunan bir lekeleme zarına aktarın. Islak bir filtre kağıdı ile örtün ve proteinleri jelden zara elektro-transfer edin.

Membranı, p53'e bağlanan anti-p53 antikorları ile tedavi edin. Antikor-p53 komplekslerine bağlanan enzim konjuge ikincil antikorlarla kaplama. Lüminesan ürün oluşturmak ve zarı görüntülemek için kemilüminesan bir substrat ekleyin.

Daha yüksek bir moleküler ağırlık bandı, SUMOile edilmiş proteinlere karşılık gelirken, daha düşük bant, SUMOile edilmemiş protein varyantlarına karşılık gelir.

İn vitro SUMOylation ana karışım reaksiyonunda mikrolitre saflaştırılmış tag-K-bZIP başına 3 mikrolitre 100 nanogram ekleyin. Daha sonra, ana karışımın içeriğini hafifçe karıştırın ve 30 santigrat derecede 3 saat inkübe edin.

Ardından, reaksiyonu durdurmak için yükleme tamponlu 20 mikrolitre 2x SDS-PAGE ekleyin. Ardından, proteini denatüre etmek için numuneleri 95 santigrat derecede 5 dakika ısıtın.

Daha sonra, numunenin 20 mikrolitresini %10'luk bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve jeli 80 voltta yaklaşık 120 dakika boyunca boya jelin dibine ulaşana kadar çalıştırın.

Elektroforez bittiğinde, jel aparatını ayırın ve jeli 5 dakika boyunca yarı kuru transfer tamponuna aktarın. Ardından, PVDF membranını metanol ile doldurulmuş başka bir kapta 1 dakika bekletin.

PVDF membranını metanolden çıkarın ve yarı kuru transfer tamponuna batırın. Ardından, zarı 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.

Yarı kuru elektroforetik aparatın güvenlik kapağını çıkarın. Bir filtre kağıdını önceden ıslatın ve platin anodun altına bir jel sandviç hazırlayın. Katot plakasını güvenlik kapağına sabitledikten sonra, lekeyi 15 dakika boyunca 90 volt sabit akımda çalıştırın. Ardından, yarı kuru cihazın bağlantısını kestikten sonra güç kaynağını kapatın ve PVDF membranını çıkarın.

Şimdi, PVDF membranını dakikada 30 devirde bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici tampon ile bloke edin. Daha sonra, PVDF membranını anti-p53 antikoru ve bloke edici tampon ile 4 santigrat derecede 12 ila 16 saat boyunca, dakikada 30 devirde bir süspansiyon karıştırıcı üzerinde hibritleyin.

Ardından, PVDF membranını çıkarın ve Tween-20 ile TRIS tamponlu tuzlu su ile doldurulmuş bir kaba aktarın. Daha sonra, PVDF membranını Tween-20 ile TRIS tamponlu tuzlu su içinde yörünge çalkalayıcı üzerinde dakikada 45 devirde 30 dakika bekletin. Daha sonra, PVDF membranını, süspansiyon karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş anti-tavşan antikoru ile dakikada 30 devirde hibritleştirin.

Ardından, PVDF membranını TRIS tamponlu tuzlu su ile Tween-20 ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, PVDF membranını TRIS tamponlu tuzlu su Tween-20 içinde süspansiyon karıştırıcısında dakikada 45 devirde 30 dakika bekletin. Ardından, PVDF membranını 4 santigrat derecede 12 saate kadar korumak için TRIS tamponlu salin Tween-20'yi fosfat tamponlu salin ile değiştirin.

Ardından, geliştirilmiş kemilüminesan substrat reaktifleri 1 ve 2'yi 1:1 oranında karıştırın. Ardından, PVDF membranını fosfat tamponlu tuzlu sudan çıkarın ve fazla nemi emmek için zımba cepleriyle kısa bir süre kurulayın.

Hemen, membran yüzeyine 400 mikrolitre kemilüminesan reaktif ekleyin ve 3 ila 5 dakika bekleyin. Fazla kemilüminesan reaktifi boşaltmak için kısa bir süre kurulayın ve zarın tamamen kurumasını önleyin. Lekeyi ortaya çıkarmak için lüminesans görüntüleme sistemini kullanın.